生細胞におけるペルオキシレドキシンのオリゴマー化ダイナミクスのリアルタイムモニタリング

Real-time monitoring of peroxiredoxin oligomerization dynamics in living cells.

• Daniel Pastor-Flores
• Deepti Talwar
• Brandán Pedre
• Tobias P Dick

抄録

ペルオキシリドキシンは、細胞の酸化還元恒常性とシグナル伝達の中心的な役割を果たしています。ペルオキシリドキシンは、条件や状況に応じて、過酸化物消去剤、センサー、シグナル伝達物質、シャペロンとして機能します。典型的な2-Cysペルオキシリドキシンは、酸化還元状態、pH、翻訳後修飾、および他の要因に応じて、異なるオリゴマー状態の間で切り替わることが知られています。第四紀状態とその変化はペルオキシリドキシンの活性と機能に密接に関係していますが、これまでのところ、ほとんど生細胞の外で研究されてきました。ここでは、ホモ-FRET（同一の蛍光体間のフェルスター共鳴エネルギー移動）蛍光偏光法を用いて、生細胞の混雑した環境下でのペルオキシリドキシン四元構造の動的変化をモニターする方法を紹介します。この手法を用いて、ペルオキシドキシンとチオレドキシンに関連した四量体転移が細胞内で起こることを確認し、二量体-二量体転移とサブユニット間のジスルフィド結合形成の関係がこれまで考えられていたよりも複雑であることを明らかにしました。さらに、異なるペルオキシリドキシンのアイソフォームを比較し、細胞内のオリゴマー状態に影響を与える変異や小分子を同定するために、この手法を用いることを実証した。突然変異誘発実験により、二量体とデカマーの平衡は微妙にバランスが取れており、単一原子の構造変化によって変化することが明らかになった。この知見を用いて、ペルオキシリドキシンベースのレドックスセンサーの設計を改善する方法を示す。

Peroxiredoxins are central to cellular redox homeostasis and signaling. They serve as peroxide scavengers, sensors, signal transducers, and chaperones, depending on conditions and context. Typical 2-Cys peroxiredoxins are known to switch between different oligomeric states, depending on redox state, pH, posttranslational modifications, and other factors. Quaternary states and their changes are closely connected to peroxiredoxin activity and function but so far have been studied, almost exclusively, outside the context of the living cell. Here we introduce the use of homo-FRET (Förster resonance energy transfer between identical fluorophores) fluorescence polarization to monitor dynamic changes in peroxiredoxin quaternary structure inside the crowded environment of living cells. Using the approach, we confirm peroxide- and thioredoxin-related quaternary transitions to take place in cellulo and observe that the relationship between dimer-decamer transitions and intersubunit disulfide bond formation is more complex than previously thought. Furthermore, we demonstrate the use of the approach to compare different peroxiredoxin isoforms and to identify mutations and small molecules affecting the oligomeric state inside cells. Mutagenesis experiments reveal that the dimer-decamer equilibrium is delicately balanced and can be shifted by single-atom structural changes. We show how to use this insight to improve the design of peroxiredoxin-based redox biosensors.

Copyright © 2020 the Author(s). Published by PNAS.