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6種の豚病原体の同時検出のためのマルチプレックスオリゴヌクレオチドマイクロアレイの開発
Development of multiplex oligonucleotide microarray for simultaneous detection of six swine pathogens.
PMID: 32598896 DOI: 10.1016/j.jviromet.2020.113921.
抄録
APP、HPS、PRRSV、Mhp、PCV-2、CSFVの6つの主要病原体を同時に検出するハイスループット同定技術を確立するために、病原体の特異的な保存配列に基づいて6組のプライマーとプローブを設計し、マルチプレックスPCRシステムを開発し、ハイブリッドパラメータを最適化し、技術の評価を行った。その結果、本検出法の感度はAPPが5.8×10copies/μL、HPSが7.8×10copies/μL、6．Mhpは8×10コピー/μL、PCV-2は6.3×10コピー/μL、PRRSVは4.8×10コピー/μL、5．5×10コピー/μLであり，豚由来のシュードラビースウイルス，豚パルボウイルス，日本B型脳炎ウイルス，豚小水疱性疾患ウイルス，小水疱性口内炎ウイルス，口蹄疫ウイルス，ブルートンウイルス，反芻動物ペストウイルス，サルモネラなどの9つの病原体との交差反応は認められなかった．今回確立したマルチプレックスオリゴヌクレオチドマイクロアレイを285検体の臨床血液に適用したところ，単一感染率は18.2％（52/285検体），混合感染率は6.3％（18/285検体）であり，塩基配列の検証結果と一致した．この技術は，複数の病原体の流行調査や臨床診断のための迅速かつハイスループットな検出法として有用であると考えられる。
In order to establish a high-throughput identification technique that simultaneously detects six major pathogens including APP, HPS, PRRSV, Mhp, PCV-2 and CSFV, six pairs of primers and probes were designed based on the specific conservative sequences of the pathogens, a multiplex PCR system was developed, hybrid parameters were optimized, and evaluation of the technology was performed. The results showed that the present detection method had a sensitivity of 5.8 × 10copies/μL for APP, 7.8 × 10 copies/μL for HPS, 6.8 × 10 copies/μL for Mhp, 6.3 × 10 copies/μL for PCV-2, 4.8 × 10 copies/μL for PRRSV, and 5.5 × 10 copies/μL for CSFV, respectively; and it produced no cross reaction against the other nine pathogens like swine-origin pseudorabies virus, porcine parvovirus, Japanese B encephalitis virus, swine vesicular disease virus, vesicular stomatitis virus, foot-and-mouth disease virus, bluetongue virus, peste des petits ruminants virus and salmonella. Application of the multiplex oligonucleotide microarray established here to testing 285 clinical blood samples indicated a single infection rate of 18.2 % (52/285) and a mixed infection rate of 6.3 % (18/285) which were consistent with the results of the sequencing verification. This technique might serve as a rapid and high-throughput method of detection for epidemic investigation and clinical diagnosis of multiple pathogens.
Copyright © 2020. Published by Elsevier B.V.