POEイムノアッセイ。生物学的マトリックス中の核酸を定量するためのプレートベースのオリゴヌクレオチド電気化学発光イムノアッセイ

POE Immunoassay: Plate-based oligonucleotide electro-chemiluminescent immunoassay for the quantification of nucleic acids in biological matrices.

• Mai B Thayer
• Sara C Humphreys
• Kyu S Chung
• Julie M Lade
• Kevin D Cook
• Brooke M Rock

抄録

オリゴヌクレオチド治療薬は、短い干渉RNA（siRNA）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）分子を使用して、内因性のシステムを利用して標的RNAを中和し、その後のタンパク質の翻訳を阻止します。臨床応用の可能性は広大であるが、送達効率と肝外標的化は困難である。これらの複雑な関係を理解するためには、生物分析アッセイが重要である。文献には、複雑な生物学的マトリックス中のsiRNAおよびASOを測定するための堅牢で感度の高い方法の記述が現在のところ欠けている。ここに記載されているのは、血清、尿、胆汁、肝臓および腎臓のホモジネート中の個々のsiRNAストランド（アンチセンスまたはセンス）の定量を可能にする非酵素的ハイブリダイゼーションベースのイムノアッセイです。アッセイの有用性は、ASOにおいても実証されています。本アッセイは、酵素ステップを廃止し、分析対象物のハイブリダイゼーション親和性を高め、感度、特異性、ロバスト性を向上させるためにLocked Nucleic Acid (LNA)ヌクレオチド修飾をさらに組み込むことで、これまでの研究を改良したものである。我々は、血清中の siRNA のための 0.3 ～ 16,700 pM の超高感度ダイナミックレンジを持つアッセイを報告します。このアッセイは、血清と組織マトリックスの両方で精度と精度のための完全な資格に提出され、アッセイ性能は、単一および混合分析物で評価されました。信頼性の高い LNA ハイブリダイゼーションをベースとしたアプローチにより、より高度な化学修飾によって阻害される可能性のあるマトリックスサンプルの抽出、濃縮、増幅のステップが不要になります。

Oligonucleotide therapeutics use short interfering RNA (siRNA) or antisense oligonucleotide (ASO) molecules to exploit endogenous systems-neutralizing target RNA to prevent subsequent protein translation. While the potential clinical application is vast, delivery efficiency and extrahepatic targeting is challenging. Bioanalytical assays are important in building understanding of these complex relationships. The literature currently lacks description of robust and sensitive methods to measure siRNA and ASOs in complex biological matrices. Described herein is a non-enzymatic hybridization-based immunoassay that enables quantification of individual siRNA strands (antisense or sense) in serum, urine, bile, and liver and kidney homogenates. Assay utility is also demonstrated in ASOs. The assay improves upon previous works by abolishing enzymatic steps and further incorporating Locked Nucleic Acid (LNA) nucleotide modifications to increase analyte hybridization affinity and improve sensitivity, specificity, and robustness. We report an assay with an ultrasensitive dynamic range of 0.3 to 16,700 pM for siRNA in serum. The assay was submitted to full qualification for accuracy and precision in both serum and tissue matrices and assay performance was assessed with single and mixed analytes. The reliable LNA-hybridization-based approach removes the need for matrix sample extraction, enrichment or amplification steps which may be impeded by more advanced chemical modifications.