タンデムマスタグを用いたヒト血漿の定量的プロテオミクス解析による帯状疱疹の新規バイオマーカーの同定

Quantitative proteomic analysis of human plasma using tandem mass tags to identify novel biomarkers for herpes zoster.

• Tingting Wang
• Hui Shen
• Housheng Deng
• Huan Pan
• Qiuli He
• Huadong Ni
• Jiachun Tao
• Songlei Liu
• Longsheng Xu
• Ming Yao

抄録

帯状疱疹（HZ）は、一般的に帯状疱疹と呼ばれ、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）の再活性化によって引き起こされる特徴的な症候群です。帯状疱疹患者の生物学的特徴をよりよく理解することで、新たな標的治療法を開発して予後を改善することができます。ハイスループットプロテオミクス技術は、深くHZ病の発生と進行の分子変化を研究し、情報の異なるレベルを統合することができ、これは臨床的な意思決定を支援することが重要です。循環血液には多くの生物学的情報が含まれていますが、私たちは、HZの発症を示す可能性のある重要なタンパク質を特定することを期待して、患者の血漿のプロテオミクス研究を実施しました。健康なヒト血漿と比較して、HZ患者の血漿中には44種類の異なる発現を示すタンパク質が検出されました。これらの分子に関与する主な経路は、MAPKシグナル伝達経路、神経活性リガンド-受容体相互作用、急性骨髄性白血病、癌における転写ミスレギュレーションです。その結果、27個のタンパク質が直接的なタンパク質間相互作用を持つことが判明した。この総合的なスコアに基づいて、6つの重要な分子をさらなる研究の候補分子として同定し、さらに80個の血漿サンプル（HZ患者血漿40個、健常者血漿40個）について、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、免疫ブロット法、およびレシーバー操作特性（ROC）曲線分析を用いて検証しました。最後に、これら3つのタンパク質（PLG、F2、VTN）の発現レベルが健常対照者よりも有意に低いことを発見した（P<.05）。我々の知る限りでは、我々は最初にタンデム質量タグ（TMT）と液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS/MS）を組み合わせて、HZ患者と健常者との間で血漿中に発現しているタンパク質の違いをスクリーニングするために使用しました。その結果、HZ患者の血漿中のタンパク質発現プロファイルが非感染者の血漿中のタンパク質発現プロファイルと異なることが事前に証明され、これら3つの主要なタンパク質が変化していることが明らかになりました。本研究は、HZの早期感染者をより正確に特定し、新たな治療標的を見つけるのに役立つ、HZについての新たな知見を明らかにした。重要性：水痘帯状疱疹ウイルス（VZV；国際ウイルス分類学委員会ではヒトαヘルペスウイルス3と呼ばれている）は、ヒトに遍在するヘルペスウイルスであり、水痘や帯状疱疹（HZ）を引き起こす可能性があります。水痘の初期感染後、水痘ウイルスは感覚神経節や頭蓋神経で休眠状態になります。加齢や免疫抑制が進むと、水痘に対する細胞免疫が低下し、ウイルスが再活性化して感覚神経に沿って皮膚に広がり、独特の前駆性疼痛とそれに続く発疹を引き起こします。世界中で約5人に1人がVZVに感染していると言われています。統計によると、感染者の約3分の1が生涯にHZを発症し、米国では毎年100万人の帯状疱疹患者が発生していると推定されています。帯状疱疹はどの年齢でも発症する可能性があり、通常、小児や若年成人では重症度が低いのですが、高齢者や免疫不全の患者では最大の罹患率と死亡率が認められます。HZ患者の20％が血管炎、心筋梗塞のリスク上昇、帯状疱疹後神経痛などの合併症を有しており、米国におけるHZ患者の全死亡率は5％に近い。この疾患の広範な臨床重症度と合併症を考慮すると、早期診断、リスクの分類、転帰の予測に寄与するバイオマーカーが大いに必要とされており、これらの疾患の臨床発症メカニズムの解明に役立つと考えられる。定量プロテオミクスは、生物学の有用なツールとして、様々な生物学的サンプル中のタンパク質を繰り返し同定し、正確に定量することができます。プロテオミクス解析では、ほとんどの生物学的プロセスで直接的な役割を果たしている翻訳タンパク質に焦点を当てています。ELISAやウエスタンブロッティングなどの従来の方法では、少数のタンパク質を同時に調べることができますが、典型的なプロテオミクス研究では、より包括的な同定のために数千個のタンパク質を同時に分析することができます。プロテオミクスは、ヒトを対象とした疾患研究への応用に成功しており、質量分析法（MS）に基づいて被曝者と非被曝者を分析することで、初期の疾患影響の中間的なバイオマーカーとして同定できるタンパク質の発現変化が明らかになることがわかっています。タンデムマスタグ（TMT）は、MSベースの生体分子の同定および定量に使用される化学ラベルです。TMTsは、細胞、組織、体液などの様々なサンプルのプロテオミクス分析において重要な役割を果たしています。臨床的に検出されることの多い体液は血液であり、入手が容易であり、生理・病理プロセスに関連する豊富な生体情報を含んでいるため、これらの血液からタンパク質バイオマーカーの開発が期待されています。そこで、HZ患者の病理過程をよりよく特徴づけるために、TMT法を用いてHZ患者と健常人血漿のプロテオミクス解析を行いました。この比較は、タンパク質プロファイリングによりHZ疾患の発症における特定のプロセスを特定することを目的としており、HZの生物学的理解の向上に役立つ可能性があります。

Herpes zoster (HZ), commonly called shingles, it is a distinctive syndrome caused by reactivation of varicella zoster virus (VZV). A better understanding of the biological characteristics of HZ patients can help develop new targeted therapies to improve the prognosis. High-throughput proteomics technology can deeply study the molecular changes in the development and progression of HZ disease and integrate different levels of information, this is important to help make clinical decisions. Circulating blood contains a lot of biological information, we conducted a proteomics study of patient plasma, hoping to identify key proteins that could indicate the development of HZ. Compared to healthy human plasma, we found 44 differentially expressed proteins in the plasma of HZ patients, the main pathways involved in these molecules are MAPK signaling pathway, Neuroactive ligand-receptor interaction, Acute myeloid leukemia, Transcriptional misregulation in cancer. We found that 27 proteins have direct protein-protein interactions. Based on the comprehensive score, we identified six key molecules as candidate molecules for further study, and then validated another 80 plasma samples (40 HZ patient plasma and 40 healthy human plasma) using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot assay and receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. Finally, we found that the expression levels of these three proteins (PLG, F2, VTN) were significantly lower than those of healthy controls (P < .05). To the best of our knowledge, we first used tandem mass tag (TMT) combined with liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) to screen for differentially expressed proteins in plasma between HZ patients and healthy individuals. It is preliminarily proved that the plasma protein expression profile of HZ patients is different from that of uninfected patients, it has also been found that these three altered key proteins may be used as biomarkers to test early HZ infection. This study reveals new insights into HZ that help to more accurately identify early HZ patients and to find new therapeutic targets. SIGNIFICANCE: Varicella-zoster virus (VZV; termed human alphaherpesvirus 3 by the International Committee on Taxonomy of Viruses) is a herpesvirus that is ubiquitous in humans and can cause chickenpox and herpes zoster (HZ). After the initial infection of varicella, the VZV goes into a dormant state in the sensory ganglia and cranial nerves. As age or immunosuppression increases, the cellular immunity to VZV decreases, and the virus reactivates and spreads along the sensory nerves to the skin, causing a unique prodromal pain followed by a rash. About one in five people around the world may be infected with VZV at some point in their lives. According to statistics, about one-third of infected people will develop HZ in their lifetime, and an estimated 1 million cases of herpes zoster occur in the United States each year. Herpes zoster can occur at any age and is usually less severe in children and young adults, but the greatest morbidity and mortality are observed in elderly and immunocompromised patients. 20% of patients with HZ have complications including vasculitis, increased risk of myocardial infarction, or postherpetic neuralgia, the overall mortality rate of patients with HZ in the United States is close to 5%. Considering the wide clinical severity and complications of this disease, there is a great need for biomarkers that contribute to early diagnosis, classification of risks, and prediction of outcomes, which will help elucidate the mechanisms underlying their clinical development. As a useful tool in biology, quantitative proteomics can repeatedly identify and accurately quantify proteins in a variety of biological samples. Proteomic analysis focuses on translational proteins, which play a direct role in most biological processes. Although a small number of proteins can be studied simultaneously with traditional methods, such as ELISA and Western blotting, typical proteomics studies can simultaneously analyze thousands of proteins for a more comprehensive identification. Proteomics has been successfully applied to human-based disease research, Analysis of exposed and unexposed subjects based on mass spectrometry (MS) has been found to reveal altered expression of proteins that can be identified as intermediate biomarkers of early disease effects. Tandem mass tags (TMTs) are chemical labels used for MS-based identification and quantification of biological molecules. TMTs play an important role in proteomic analysis in a variety of samples such as cells, tissues, and body fluids. The body fluids that are often detected clinically are blood, which are easy to obtain and contain abundant biological information related to physiological and pathological processes, we hope to develop protein biomarkers from these blood. Therefore, in order to better characterize the pathological process of HZ patients, we performed proteomic analysis of HZ patients and healthy human plasma using the TMT method. This comparison aims to identify specific processes in the development of HZ disease through protein profiling, which may help to improve our biological understanding of HZ.

Copyright © 2020 The Author(s). Published by Elsevier B.V. All rights reserved.