3種のFritillariaにおけるスクアレン・エポキシダーゼの比較解析と自然進化

Comparative analysis and natural evolution of squalene epoxidase in three Fritillaria species.

• Xu Lu
• Lin-Ning Zhang
• Jin-Fa Du
• Xiao-Yan Zheng
• Hui-Jun Li
• Ping Li
• Gui-Zhong Xin
• Yan Jiang

抄録

Fritillariae Bulbusは中国で最も一般的に使用されている鎮咳作用のある食用ハーブである。UPLC-QTOF-MSとUPLC-QQ-MSに基づいて、有効なMRMベースの非標的定量法を適用して、3つのFritillaria種（F. thunbergii Miq.、F. unibracteata、F. ussuriensis）の48個のFritillariaアルカロイド（FA）の含有量を決定した。RNA-Seqの結果、3種のFritillariaでは遺伝子の転写レベルが異なる発現パターンを示した。トランスクリプトームデータに基づいて、スクアレン・エポキシダーゼ遺伝子の完全長cDNA配列をクローニングし、特徴付けを行った。スクアレンエポキシダーゼ遺伝子の自然進化により、3種のFritillariaで4つの変異（C236R, M489L, G510A, K517R）が発生した。分子ドッキング解析の結果、236残基はポケットと結合中心の内側に位置し、他の3つの残基はタンパク質表面に位置していることがわかった。その結果、SQE (C236R) の変異は、SQE の活性を効果的に高め、組換え酵母での 2,3-オキソスクオレンの収率を高めることができた。また、タンパク質表面の疎水性を高めるSQEの変異（M489L、G510A）も、SQEの活性を高めることができた。本研究は、FAs生合成の代謝物分化に関する大きな知見を提供するものであり、Fritillariae bulbusの品質管理や代謝工学の基礎となるものである。

Fritillariae Bulbus are the most commonly used antitussive and edible herbs in China. Based on UPLC-QTOF-MS and UPLC-QQQ-MS, the validated MRM-based non-targeted quantitative method was applied to determinate the contents of 48 Fritillaria alkaloids (FAs) in three Fritillaria species (F. thunbergii Miq., F. unibracteata and F. ussuriensis). The RNA-Seq results showed that gene transcript levels have different expression patterns in three Fritillaria species. Based on transcriptome data, the full-length cDNA sequences of squalene epoxidase gene were cloned and characterized. Natural evolution of squalene epoxidase genes resulted in four mutations (C236R, M489L, G510A and K517R) in three Fritillaria species. Molecular docking analysis showed that the 236 residue is located inside the pocket and the binding center while other three residues are located on the surface of the protein. Functional verification indicated the mutations of SQE (C236R) could effectively increase the activity of SQE and obtain higher yield of 2,3-oxidosqualene in recombinant yeast. And the mutations of SQE (M489L and G510A), which increased the hydrophobicity of the protein surface, could also enhance the activity of SQE. This study provides major insights into the metabolites differentiation of FAs biosynthesis, and a firm foundation for the quality control and metabolic engineering of Fritillariae bulbus.