共焦点顕微鏡による腎細胞型特異的in situサイトカイン産生のための新規免疫蛍光検出法

A novel immunofluorescence detection method for renal cell-type specific in situ cytokine production by confocal microscopy.

• Sun-Sang J Sung
• Shu Man Fu

抄録

組織内でのサイトカイン産生の検出には大きな制限がある。(1)サイトカインのタンパク質産生はmRNAレベルと相関しないことが多い。(2) サイトカインは急速に分泌され、細胞源から散逸するため、検出が困難である。(3) 多くのサイトカインの合成率が低い。(4)組織固定により抗原部位が破壊され、検出シグナルが低下する。サイトカインの細胞源の同定は、適切で容易に利用可能な細胞マーカーがないため、さらなる課題となっています。我々は、ループス腎炎における腎サイトカイン産生研究において、糸球体と間質における適切なサイトカインの細胞源の同定に関連する問題を解決するための方法を確立しました。4色共焦点顕微鏡を用いて、細胞型特異的マーカーとサイトカインをコロケーションさせた。サイトカインシグナルは、パン特異的刺激剤と分泌遮断剤を含む培地中での組織スライスのインキュベーションによって増幅された。組織固定は、シャープで鮮明なシグナルを提供するように最適化された。フルオロクローム標識に適した市販のAbを、尿細管および糸球体における細胞特異的マーカーを確立するために使用した。この最適化の組み合わせにより、糸球体腎炎の病態におけるサイトカイン回路を形成するように見えるTNF-α、IL-6、およびIL-1βを含む重要な糸球体サイトカインの細胞源を定義することができた。サイトカイン検出のための組織刺激と分泌ブロッキング ●サイトカイン検出のための固定化最適化と直接染色のためのAbソース同定 ●サイトカインと腎細胞型特異的マーカーのコロカライゼーション ●サイトカインと腎細胞型特異的マーカーのコロカライゼーション

The detection of cytokines production in tissues is subjected to significant limitations: (1) Cytokine protein production frequently does not correlate with mRNA levels. (2) Cytokines are secreted rapidly and dissipate from the cellular source, thus making detection difficult. (3) The synthetic rate of many cytokines are low. (4) Tissue fixation ablates antigenic sites and diminishes detection signals. The identification of the cellular sources of cytokines poses an additional challenge because of the lack of suitable and readily available cellular markers. In our renal cytokine production studies in lupus nephritis, we have established methods to resolve problems associated with the identification of cellular sources of pertinent cytokines in the glomerulus and interstitium. Four-color confocal microscopy was used to colocalize cell-type specific markers with cytokines. The cytokine signal was amplified by the incubation of tissue slices in medium containing pan-specific stimulants plus secretion blockers. Tissue fixation was optimized to provide sharp crisp signals. Commercially available Ab suitable for fluorochrome labeling were used to establish cell-specific markers in the tubules and glomeruli. This combination of optimizations allowed us to define the cellular sources of important glomerular cytokines including TNF-α, IL-6, and IL-1β which appear to form a cytokine circuit in glomerulonephritis pathogenesis. ● Tissue stimulation and secretion blocking for cytokine detection ● Fixation optimization and Ab source identification for direct staining ● Colocalization of cytokines and renal cell-type specific markers.

© 2020 The Author(s). Published by Elsevier B.V.