リポ多糖類誘導BV2マイクログリア活性化におけるサイクリン依存性キナーゼ2を標的としたコスツノリドの抗神経炎症作用

Costunolide Plays an Anti-Neuroinflammation Role in Lipopolysaccharide-Induced BV2 Microglial Activation by Targeting Cyclin-Dependent Kinase 2.

• Yan-Chen Liu
• Na Feng
• Wei-Wei Li
• Peng-Fei Tu
• Jian-Ping Chen
• Jing-Yan Han
• Ke-Wu Zeng

抄録

脳内のミクログリアの高活性化は神経炎症と密接な関係があり、神経細胞の機能障害を引き起こす。コスツノリド（CTL）は天然のセスキテルペン系ラクトンであり、抗炎症作用や抗酸化作用など幅広い薬理活性を有している。本研究では、CTLがリポ多糖（LPS）刺激BV2ミクログリアにおいて、一酸化窒素、IL-6、TNF-α、PGE2などの炎症性メディエーターの産生を有意に抑制することを明らかにした。さらに、CTLはIKKβ/NF-κBシグナル伝達経路の活性化を効果的に抑制した。CTLの直接の標的となる細胞を同定するために、scPDBタンパク質構造ライブラリーを用いたハイスループットな逆仮想スクリーニングアッセイを行ったところ、サイクリン依存性キナーゼ2（CDK2）が最も特異的にCTLに結合していることが判明しました。さらに、CDK2とCTLの結合能は、CELLELLER THERMAL SHIFT ASSAY（CETSA）やDARTS ASSAY（DARTS）を用いて確認した。また、表面プラズモン共鳴解析により、CTLがマイクロモルレベルでの解離定数をもってCDK2に特異的に結合していることが確認された。さらに、CDK2 をノックダウンすると、CTL の AKT/IKKβ/NF-κB シグナル経路を介した抗炎症効果が明らかに逆転した。以上の結果から、CTLはCDK2を直接標的とすることで、ミクログリアが介在する神経炎症を抑制することが明らかになり、CDK2の抗炎症治療ターゲットとしての役割が明らかになりました。

Hyperactivation of microglia in the brain is closely related to neuroinflammation and leads to neuronal dysfunction. Costunolide (CTL) is a natural sesquiterpene lactone with wide pharmacological activities including anti-inflammation and antioxidation. In this study, we found that CTL significantly inhibited the production of inflammatory mediators including nitric oxide, IL-6, TNF-α, and PGE2 in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 microglia. Moreover, CTL effectively attenuated IKKβ/NF-κB signaling pathway activation. To identify direct cellular target of CTL, we performed high-throughput reverse virtual screening assay using scPDB protein structure library, and found cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) was the most specific binding protein for CTL. We further confirmed the binding ability of CTL with CDK2 using cellular thermal shift assay (CETSA) and drug affinity responsive target stability (DARTS) assays. Surface plasmon resonance analysis also supported that CTL specifically bound to CDK2 with a dissociation constant at micromole level. Furthermore, knocking down CDK2 obviously reversed the anti-inflammation effect of CTL via AKT/IKKβ/NF-κB signaling pathway on BV-2 cells. Collectively, these results indicate that CTL inhibits microglia-mediated neuroinflammation through directly targeting CDK2, and provide insights into the role of CDK2 as a promising anti-neuroinflammation therapeutic target.