塩化ニチジンは、癌幹様の出現を抑制し、大腸癌細胞のミトコンドリア膜の変質を潜在的に調節する

Nitidine chloride inhibits the appearance of cancer stem-like properties and regulates potential the mitochondrial membrane alterations of colon cancer cells.

• Hongyan Gong
• Li Wang
• Jing Zhao
• Lixin Wang
• Qiangzong Yu
• Yong Wan

抄録

背景:

塩化ニチジン（NC）は、天然のアルカロイドであり、様々な癌の腫瘍増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する。しかし、塩化ニチジンの大腸がん細胞に対する効果については、これまで広く研究されていませんでした。

Background: Nitidine chloride (NC) is a natural alkaloid that can inhibit tumor growth and induce apoptosis in varieties of cancers. However, the effec12/268t of NC on colon cancer (CC) cells has not been extensively studied.

方法:

コンロン癌SW480細胞をDMEM培地中で異なる濃度のNC（0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200μM）で24時間処理した。ウェスタンブロット（WB）を用いて、Ki67、PCNA、NANOG、SOX2、OCT4、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT3、P65およびp-P65などの関連タンパク質の発現を検出した。ペレット形成実験は、幹細胞のペレット形成を検出するために用いた。JC-1実験は、ミトコンドリア膜電位の変化を検出するために行った。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の活性とマロンジアルデヒド（MDA）の含有量を検出するキットを行った。インビトロ実験の結果を検証するために、インビトロ実験を行った。マウス組織におけるアポトーシスの検出には、TUNELアッセイを用いた。組織内のKi67およびOCT4タンパク質の発現を検出するためにIHCを用いた。

Methods: Conlon cancer SW480 cells was treated with different concentrations of NC (0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, and 200 µM) in DMEM medium for 24 hours. Western blotting (WB) was used to detect the expression of related proteins, such as Ki67, PCNA, NANOG, SOX2, OCT4, Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-9, ERK1/2, p-ERK1/2, AKT, p-AKT, STAT3, p-STAT3, P65 and p-P65. The pellet formation experiment was used to detect the pellet formation of stem cells. The JC-1 experiment was used to detect the change of mitochondrial membrane potential. Kit was performed to detect the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA). In vivo experiments were used to verify the results of in vitro experiments. TUNEL assay was designed to detect the apoptosis in mice tissue. IHC was used to detect expression of Ki67 and OCT4 protein in tissue.

結果:

NCは、Ki-67および増殖細胞核抗原（PCNA）の発現レベルを有意に阻害した。NCは、腫瘍幹細胞のペレットコロニーおよびペレットサイズを減少させ、CC細胞の幹細胞特性をブロックすることができる。対応する幹細胞マーカー分子NANOG、SOX2、およびOCT4もまた、ダウンレギュレートされた。NC処理はCC細胞のミトコンドリア膜電位の脱分極を誘導した。カスパーゼ-3, カスパーゼ-9, Baxなどのプロアポトーシス蛋白質の発現が上昇し、アポトーシスBcl-2の発現が有意に低下した。さらに、NCはCC細胞のSOD活性とMDA含量を低下させた。さらに、経路のリン酸化に関する研究から、NCはp-erkおよびp-aktタンパク質の発現を抑制することが示された。最後に、ヌードマウスを用いた実験でさらに結果を確認した。NCはマウスの腫瘍増殖を抑制した。NCは組織のアポトーシスを促進した。NCは組織におけるKi67およびOCT4の発現を抑制した。NCは組織内の経路蛋白ERK1/2およびAKTのリン酸化を抑制した。

Results: NC significantly inhibited the expression levels of Ki-67 and a proliferating cell nuclear antigen (PCNA). NC can reduce the pellet colony and pellet size of tumor stem cells and block the stem cell characteristics of CC cells. The corresponding stem cell marker molecules NANOG, SOX2, and OCT4 were also downregulated. NC treatment induced the mitochondrial membrane potential depolarization of CC cells. The expression of pro-apoptotic proteins such as caspase-3, caspase-9, and Bax were upregulated, while the expression level of apoptotic Bcl-2 was significantly down-regulated. Moreover, NC reduced SOD activity and MDA content in CC cells. In addition, studies on pathway phosphorylation have shown that NC inhibits the expression of p-erk and p-akt proteins. Finally, the results were further confirmed by experiments in nude mice. NC inhibited tumor growth in mice. NC promoted apoptosis in tissues. NC inhibited the expression of Ki67 and OCT4 in tissues. NC inhibited the phosphorylation of pathway proteins ERK1/2 and AKT in tissues.

結論:

NC 投与により、CC 組織の増殖・幹細胞化が抑制され、腫瘍組織のアポトーシスが促進され、腫瘍組織における p-ERK および p-AKT の発現が抑制されたことから、NC が ERK および AKT の経路制御に重要な役割を果たしている可能性が示唆されました。

Conclusions: NC treatment inhibited the proliferation and stemness of CC tissues, promoted the apoptosis of tumor tissues, downregulated the expression of p-ERK and p-AKT in tumor tissues, which suggests that NC may play an important role in regulating ERK and AKT pathways.

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