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Etoposide耐性ヒト網膜芽細胞腫細胞株における細胞外マトリックスの発現変化と影響
Expression Changes and Impact of the Extracellular Matrix on Etoposide Resistant Human Retinoblastoma Cell Lines.
PMID: 32560557 DOI: 10.3390/ijms21124322.
抄録
網膜芽細胞腫（RB）は、世界的に最も一般的な小児の悪性眼腫瘍である。いくつかの研究では、細胞外マトリックス（ECM）が腫瘍の増殖および転移において重要な役割を果たしていることが示されている。さらに、最近の研究では、ECMの組成が化学療法薬に対する抵抗性の発現に影響を与える可能性があることが示されている。本研究の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、親ヒト細胞株WERI-RB1（網膜芽細胞腫1）およびY79とそれらのエトポシド耐性サブクローンのECMコンパートメントにおける発現の違いを評価することである。タンパク質レベルを解析するためにウエスタンブロット分析を行った。RB細胞の増殖、死滅およびクラスター形成に対するECM分子の影響を調べるために、WERI-RB1および耐性WERI-ETOR細胞をフィブロネクチン、ラミニン、テナシン-CおよびコラーゲンIV上で培養し、タイムラプスビデオ顕微鏡および免疫細胞化学を用いて解析した。その結果、抵抗性WERI-ETOR細胞では、感受性の高いWERI-RB1細胞と比較して、プロテオグリカンのmRNA発現が有意に減少していることが明らかになった。さらに、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ組織阻害剤、インテグライン受容体サブユニット、およびすべてのアイソフォームの発現低下が検出された。Tenascin-C と MMP-2 の蛋白質レベルは両 WERI 細胞株で同等であった。興味深いことに、フィブロネクチンはWERI-RB1細胞に対してアポトーシス誘導作用を示したが、テナシン-Cは抗アポトーシス作用を示した。逆に、WERI-ETOR細胞の増殖はTenascin-Cで促進され、Fibronectinでは抗増殖作用が観察された。WERI-ETORでは、基質であるCollagen IV、Fibronectin、Tenascin-Cでクラスター形成が減少した。以上のことから、エトポシド耐性RB細胞と感受性RB細胞では、ECM mRNAの発現と挙動が異なることが明らかになった。これらの知見は、RBの化学療法抵抗性形成におけるECM成分の重要な役割を示している可能性がある。
Retinoblastoma (RB) represents the most common malignant childhood eye tumor worldwide. Several studies indicate that the extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in tumor growth and metastasis. Moreover, recent studies indicate that the ECM composition might influence the development of resistance to chemotherapy drugs. The objective of this study was to evaluate possible expression differences in the ECM compartment of the parental human cell lines WERI-RB1 (retinoblastoma 1) and Y79 and their Etoposide resistant subclones via polymerase chain reaction (PCR). Western blot analyses were performed to analyze protein levels. To explore the influence of ECM molecules on RB cell proliferation, death, and cluster formation, WERI-RB1 and resistant WERI-ETOR cells were cultivated on Fibronectin, Laminin, Tenascin-C, and Collagen IV and analyzed via time-lapse video microscopy as well as immunocytochemistry. We revealed a significantly reduced mRNA expression of the proteoglycans , and in resistant WERI-ETOR compared to sensitive WERI-RB1 cells. Also, for the glycoproteins , , and as well as , reduced expression levels were observed in WERI-ETOR. Furthermore, a downregulation was detected for the matrix metalloproteinases , , , the tissue-inhibitor of metalloproteinase , the Integrin receptor subunits , and and all isoforms. Downregulation of , , , , and was also verified in Etoposide resistant Y79 cells compared to sensitive ones. Protein levels of Tenascin-C and MMP-2 were comparable in both WERI cell lines. Interestingly, Fibronectin displayed an apoptosis-inducing effect on WERI-RB1 cells, whereas an anti-apoptotic influence was observed for Tenascin-C. Conversely, proliferation of WERI-ETOR cells was enhanced on Tenascin-C, while an anti-proliferative effect was observed on Fibronectin. In WERI-ETOR, cluster formation was decreased on the substrates Collagen IV, Fibronectin, and Tenascin-C. Collectively, we noted a different ECM mRNA expression and behavior of Etoposide resistant compared to sensitive RB cells. These findings may indicate a key role of ECM components in chemotherapy resistance formation of RB.