リング状オリゴメリックタンパク質TRAPの最近接協力性を明らかにするネイティブ質量分析法による母集団分布

Population Distributions from Native Mass Spectrometry Titrations Reveal Nearest-Neighbor Cooperativity in the Ring-Shaped Oligomeric Protein TRAP.

• Melody L Holmquist
• Elihu C Ihms
• Paul Gollnick
• Vicki H Wysocki
• Mark P Foster

抄録

アロステリィは高分子の機能に浸透し、リガンドと高分子との協調的な結合を駆動しています。協調的なリガンド結合のメカニズムを解明するためには、各リガンドがそのエネルギー的に結合した部位に結合することによる熱力学的な結果をミクロなレベルで定義する必要があります。しかし、2つ以上の結合部位を持つ高分子では、観測可能な[核磁気共鳴(NMR)化学シフトの変化、蛍光、エンタルピーなど]がアロステリによって変化し、それによって部位占有率に比例した定数が歪められるため、これらの微視的定数を抽出することは困難です。ネイティブ質量分析（MS）は、異なる数の結合リガンドを持つホモオリゴマータンパク質種の集団を直接定量することができますが、集団がイオンカウントに比例しており、MS互換性のある電解質が全体的な熱力学を変化させない場合に限ります。これらの測定は、統計的な熱力学的分配関数への比類のないアクセスを提供することにより、アロステリックメカニズムの解読に役立ちます。我々は、ネイティブMS（nMS）を使用して、トリプトファン（Trp）のRNA結合減衰タンパク質（TRAP）、11の同一の結合部位を持つリング状のホモオリゴマータンパク質複合体への協調的な結合を研究するために使用しました。MS互換性のある溶液は、等温滴定熱量測定およびNMR分光法によって評価されるように、タンパク質の構造または熱力学を有意に摂動しなかった。Trp-TRAP状態の集団は、nMSによってTrp濃度の関数として定量化された。その結果、非協力的な結合モデルでは説明できなかったが、機械論的な最近傍協力モデルではよく説明できることがわかった。非線形最小二乗法によるフィッティングにより、隣接する結合部位間の相互作用を定義する微視的な熱力学的定数が得られた。このアプローチは、他のリング状タンパク質の熱力学的協調性の定量化にも応用できるかもしれない。

Allostery pervades macromolecular function and drives cooperative binding of ligands to macromolecules. To decipher the mechanisms of cooperative ligand binding, it is necessary to define, at a microscopic level, the thermodynamic consequences of binding of each ligand to its energetically coupled site(s). However, extracting these microscopic constants is difficult for macromolecules with more than two binding sites, because the observable [e.g., nuclear magnetic resonance (NMR) chemical shift changes, fluorescence, and enthalpy] can be altered by allostery, thereby distorting its proportionality to site occupancy. Native mass spectrometry (MS) can directly quantify the populations of homo-oligomeric protein species with different numbers of bound ligands, provided the populations are proportional to ion counts and that MS-compatible electrolytes do not alter the overall thermodynamics. These measurements can help decipher allosteric mechanisms by providing unparalleled access to the statistical thermodynamic partition function. We used native MS (nMS) to study the cooperative binding of tryptophan (Trp) to RNA binding attenuation protein (TRAP), a ring-shaped homo-oligomeric protein complex with 11 identical binding sites. MS-compatible solutions did not significantly perturb protein structure or thermodynamics as assessed by isothermal titration calorimetry and NMR spectroscopy. Populations of Trp-TRAP states were quantified as a function of Trp concentration by nMS. The population distributions could not be explained by a noncooperative binding model but were described well by a mechanistic nearest-neighbor cooperative model. Nonlinear least-squares fitting yielded microscopic thermodynamic constants that define the interactions between neighboring binding sites. This approach may be applied to quantify thermodynamic cooperativity in other ring-shaped proteins.