組換えU7 snRNPを用いた研究により、CPSF73はエンドヌクレアーゼと5'-3'エキソヌクレアーゼの両方であることが示されました

Studies with recombinant U7 snRNP demonstrate that CPSF73 is both an endonuclease and a 5'-3' exonuclease.

• Xiao-Cui Yang
• Yadong Sun
• Wei Shen Aik
• William F Marzluff
• Liang Tong
• Zbigniew Dominski

抄録

メタゾアンの複製依存性ヒストンプレmRNAは、U7 snRNPというRNAガイド型エンドヌクレアーゼによって3'末端で切断されます。最近、機能的・構造的研究のために13の構成要素すべてから完全に組換えたU7 snRNPが再構成され、ヒストンプレmRNAを正確に切断することが示された。ここでは、組換えU7 snRNPの活性をより詳細に解析した。我々は、ヒストンプレmRNAをエンドヌクレアトリー的に切断することに加えて、再構成されたU7 snRNPは、エンドヌクレアトリー的な切断の結果としてヒストンプレmRNAから生成された下流生成物を分解する5'-3'エクソヌクレアーゼとして作用することを示しています。驚くべきことに、組換えU7 snRNPはまた、一本鎖DNA基質上でエンドヌクレアーゼとして作用する。これらの活性はすべて、基質と塩基対をなすU7 snRNAの能力、およびシスまたはトランスのいずれかでのシンプレキンのN末端ドメイン（NTD）の存在に依存し、CPSF73の触媒中心内の変異によって、またはRNAポリメラーゼIIのSSU72ホスファターゼへのNTDの結合によって、廃止される。以上のことから、我々の結果は、組換えU7 snRNPが内因性のものを模倣していることを示し、CPSF73がエンドヌクレアーゼと5'-3'エキソヌクレアーゼの両方であり、β-CASPファミリーの他のメンバーの活性と一致していることを示す証拠を提供している。この結果は、CPSF73が生体内でのDNA代謝のいくつかの側面に関与している可能性を示唆しています。

Metazoan replication-dependent histone pre-mRNAs are cleaved at the 3' end by U7 snRNP, an RNA-guided endonuclease that contains U7 snRNA, seven proteins of the Sm ring, FLASH and four polyadenylation factors: symplekin, CPSF73, CPSF100 and CstF64. A fully recombinant U7 snRNP was recently reconstituted from all 13 components for functional and structural studies and shown to accurately cleave histone pre-mRNAs. Here, we analyzed the activity of recombinant U7 snRNP in more detail. We demonstrate that in addition to cleaving histone pre-mRNAs endonucleolytically, reconstituted U7 snRNP acts as a 5'-3' exonuclease that degrades the downstream product generated from histone pre-mRNAs as a result of the endonucleolytic cleavage. Surprisingly, recombinant U7 snRNP also acts an endonuclease on single-stranded DNA substrates. All these activities depend on the ability of U7 snRNA to base pair with the substrate and on the presence of the N-terminal domain (NTD) of symplekin in either cis or trans, and are abolished by mutations within the catalytic center of CPSF73, or by binding of the NTD to the SSU72 phosphatase of RNA polymerase II. Altogether, our results demonstrate that recombinant U7 snRNP functionally mimics its endogenous counterpart and provide evidence that CPSF73 is both an endonuclease and a 5'-3' exonuclease, consistent with the activity of other members of the β-CASP family. Our results also raise the intriguing possibility that CPSF73 may be involved in some aspects of DNA metabolism in vivo.

Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press for the RNA Society.