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集団遺伝学を用いて、大環状ラクトン抵抗性の状態と地域の両方に基づいてDirofilaria immitisの関連性を検討する
Using population genetics to examine relationships of Dirofilaria immitis based on both macrocyclic lactone-resistance status and geography.
PMID: 32535487 DOI: 10.1016/j.vetpar.2020.109125.
抄録
犬の心虫（Dirofilaria immitis）の感染予防は、大環状ラクトン（ML）薬の遵守的投与に基づいている。D. immitisでは大環状ラクトン系薬剤に対する耐性は十分に報告されているが、耐性株の空間的分布や有病率に関する情報はまだ少ない。本プロジェクトは、集団遺伝学的アプローチを用いて、ML 薬剤耐性の理解を深めることを目的としている。マイクロサテライト遺伝子座の大規模なパネルを開発し，12の新規高多型マーカーを同定した。これらの12のマーカーに加えて，以前に発表された5つのマーカーを用いて，薬剤感受性が確認された16株，薬剤耐性が確認された25株，薬剤耐性が疑われる10株から分離されたミクロフィラリアのプールをスクリーニングした．ミクロフィラリア抑制検査で耐性が示された分離株については、空間主成分分析（sPCoA）、近傍結合木（Neighbor Joining Trees）、ベイジアンクラスタリングのいずれも、処理前と処理後のサンプル間の高い遺伝的類似性を明らかにした。驚くべきことに、ペアワイズNeiの距離を用いて作成したNeighbor Joining treeとsPCoAでは、耐性分離株のクラスタリングは明らかにされず、ジョージア州、ルイジアナ州、ミシシッピ州で採取されたサンプルの州レベルの地理的クラスタリングも明らかにされなかった。一方，Discriminant Analysis of Principle Componentsでは，感受性，疑いのある耐性菌と耐性菌を区別することができた．しかし、耐性関連マーカーは検出されず、このクラスタリングは、複数の遺伝子座にまたがる複数の対立遺伝子の複合効果によって駆動された。さらに、同じ感染源に由来する実験室株の異なる通路間の遺伝的距離を測定したところ、予想外に大きな差が認められた。この発見は、実験室で分離された株の遺伝的構成が、遺伝子のボトルネックが原因である可能性が高く、パスのたびに大きく変化することを強く示唆している。これらのデータを総合すると、これらのデータは、耐性菌分離株およびD. immitis全体で予想されていたよりも大きな遺伝的変動性を示唆している。また，マイクロサテライトを用いたジェノタイピングでは，耐性菌の特異的な遺伝的特徴を検出することができないことも示唆された。今後のゲノム解析による耐性菌の遺伝的関係の解明が必要である。
Prevention of infection with canine heartworm (Dirofilaria immitis) is based on the compliant administration of macrocyclic lactone (ML) drugs. Resistance to ML drugs is well documented in D. immitis; however, there remains a paucity of information on the spatial distribution and prevalence of resistant isolates. This project aims to improve understanding of ML-resistance by using a population genetic approach. We developed a large panel of microsatellite loci and identified 12 novel highly polymorphic markers. These 12, and five previously published markers were used to screen pools of microfilariae from 16 confirmed drug-susceptible, 25 confirmed drug-resistant, and from 10 suspected drug-resistant field isolates. In isolates where microfilarial suppression testing indicated resistance, Spatial Principal Component Analysis (sPCoA), Neighbor Joining Trees and Bayesian clustering all revealed high genetic similarity between pre- and post-treatment samples. Somewhat surprisingly, the Neighbor Joining tree and sPCoA generated using pairwise Nei's distances did not reveal clustering for resistant isolates, nor did it reveal state-level geographic clustering from samples collected in Georgia, Louisiana or Mississippi. In contrast, Discriminant Analysis of Principle Components was able to discriminate between susceptible, suspected-resistant and resistant samples. However, no resistance-associated markers were detected, and this clustering was driven by the combined effects of multiple alleles across multiple loci. Additionally, we measured unexpectedly large genetic distances between different passages of laboratory strains that originated from the same source infection. This finding strongly suggests that the genetic makeup of laboratory isolates can change substantially with each passage, likely due to genetic bottlenecking. Taken together, these data suggest greater than expected genetic variability in the resistant isolates, and in D. immitis overall. Our results also suggest that microsatellite genotyping lacks the sensitivity to detect a specific genetic signature for resistance. Future investigations using genomic analyses will be required to elucidate the genetic relationships of ML-resistant isolates.
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