n-ブタノール処理と共焦点顕微鏡によるホスファチジン酸へのインビボ結合のための花粉管タンパク質のテスト

Testing Pollen Tube Proteins for In Vivo Binding to Phosphatidic Acid by n-Butanol Treatment and Confocal Microscopy.

• Carolin Fritz
• Benedikt Kost

抄録

細胞膜の一般的な役割は、バリアを提供し、別々の反応空間を作り出すことである。しかし、ある種の脂質に富む膜ドメインの付加的な機能が発見され、現在進行中の研究の重要な領域となっています。このような膜ドメインは、細胞内に様々なサイズスケール（例えば、ナノドメイン、マイクロドメイン）で存在し、特殊な物理的特性を持つ膜領域を表し、シグナル伝達プロセスの直接的または間接的な伝播において重要な役割を果たしています。膜（ＰＭ）内でのドメイン形成は、特定の脂質の蓄積だけでなく、特定の膜貫通タンパク質またはＰＭに関連する周辺タンパク質のリクルートをも含む。ホスファチジン酸（ＰＡ）は、重要なシグナル伝達脂質およびＰＭドメインの構成要素として認識されるようになってきている。この脂質は、生物学的または生物学的ストレス応答だけでなく、花粉管先端の成長や他の形態の極性細胞の膨張の調節にも関与している。これまでに多くのPA結合タンパク質が同定されているが、これらのタンパク質には保存されているPA相互作用モチーフが同定されていなかった。その結果、タンパク質のPAへの結合は、配列解析に基づいて予測することはできず、脂質ストリップまたはリポソームアッセイを用いて生化学的にテストする必要があります。これらのアッセイは多くの場合、有益な情報を得ることができますが、一般的には人工モデル膜の使用に基づいています。この章では、通常伸長するタバコの花粉管のPMでPAへのタンパク質の結合を分析するために使用することができる別のin vivoアッセイについて説明します。このアッセイは、ホスホリパーゼD（PLD）を阻害し、それによってホスファチジルコリン（PC）やホスファチジルエタノールアミン（PE）のような基質からPM内のPAを生成する主要な生合成経路をブロックするn-ブタノール（n-ButOH）の使用に基づいています。PLDの阻害は、PMのPA含有量を減少させ、その結果、蛍光顕微鏡を使用して分析することができますPA結合タンパク質のPMの結合レベルを減少させます。YFPタグ付きPA結合タンパク質を発現する培養タバコ花粉管のn-ButOH処理、およびこれらのタンパク質のPM会合の定量的な決定を可能にする方法が記載されています。

The general role of cellular membranes is to provide a barrier and to generate separate reaction spaces. However, additional functions of membrane domains enriched in certain classes of lipids have been discovered, which represent an important area of ongoing research. Such membrane domains can be found in cells at different size scales (e.g., nanodomains, microdomains), represent membrane regions with special physical properties and play important roles in the direct or indirect propagation of signaling processes. Domain formation within the plasma membrane (PM) does not only involve the accumulation of specific lipids, but also the recruitment of specific transmembrane or PM-associated peripheral proteins. Phosphatidic acid (PA) is increasingly recognized as an important signaling lipid and component of PM domains. This lipid is involved in the regulation not only of biotic or abiotic stress responses, but also of pollen tube tip growth and of other forms of polar cell expansion. Although many PA-binding proteins have been characterized, a conserved PA interaction motif could not be identified in these proteins. Consequently, protein binding to PA cannot be predicted based on sequence analysis, but has to be biochemically tested using lipid strip or liposome assays. Although these assays are often informative, they are generally based on the use of artificial model membranes, which compared to natural membranes contain fewer lipid types often at non-physiological concentrations. In this chapter, we describe an alternative in vivo assay that can be employed to analyze protein binding to PA at the PM of normally elongating tobacco pollen tubes. This assay is based on the use of n-butanol (n-ButOH), which inhibits phospholipase D (PLD) and thereby blocks a major biosynthetic pathway that generates PA within the PM from substrates like phosphatidylcholine (PC) or phosphatidylethanolamine (PE). PLD inhibition reduces the PA content of the PM and consequently the level of PM association of PA-binding proteins, which can be analyzed using fluorescence microscopy. Methods enabling n-ButOH treatment of cultured tobacco pollen tubes expressing YFP-tagged PA-binding proteins as well as the quantitative determination of the PM association of these proteins are described.