タンパク質の凍結乾燥に適した最大凍結濃縮液の含水率の方法の開発および分析

Method development and analysis of the water content of the maximally freeze concentrated solution suitable for protein lyophilisation.

• Ivonne Seifert
• Alessandro Bregolin
• Davide Fissore
• Wolfgang Friess

抄録

液体製剤の凍結乾燥中、第一段階である凍結濃縮液が形成されます。最大限に凍結濃縮された溶液の組成を理解することは、凍結乾燥中のバイオ医薬品のプロセス安定性を判断するのに役立つ。私たちの目的は、示差走査熱量測定（DSC）を用いて最大凍結濃縮液の含水率を測定するための適切な方法を開発することでした。3つの異なる方法を比較した。(i)最大凍結濃縮溶液のガラス転移温度T'と濃度系列の融解温度Tの切片、(ii)濃度系列の融解イベントが終了するまでのT'の発生から始まる融解エンタルピーの線形回帰、および(iii)未凍結水の量のワンポイント測定である。方法1は正確ですが、多数のサンプルの分析を必要としますが、方法3は1つのサンプルのみを必要とし、精度が損なわれます。試料調製と精度を考慮すると、方法2が最も効果的です。糖（ショ糖、トレハロース）および他の賦形剤（ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、塩酸アルギニン、クエン酸アルギニン）を含む種々の系を、抗体濃度を変えて評価し、最大凍結濃縮液の組成を評価した。凍結濃縮液は、20〜30％の含水率を示し、賦形剤にわずかに依存するが、抗体濃度には依存しなかった。我々が開発した方法論は、最大凍結濃縮溶液の組成分析に広く適用でき、凍結濃縮中のタンパク質の安定性を解明するのに役立ちます。

During freeze-drying of a liquid formulation, a freeze-concentrate is formed in the first phase, the freezing step. Understanding the composition of the maximally freeze concentrated solution can help to judge the process stability of biopharmaceuticals during lyophilisation. Our objective was to develop a suitable method to determine the water content of the maximally freeze concentrated solution using differential scanning calorimetry (DSC). Three different methods were compared: (i) the intercept of the glass transition temperature of the maximally freeze concentrated solution T' and the melting temperature T for a concentration series, (ii) the linear regression of the melting enthalpy starting from the onset of T' until the end of the melting event for a concentration series, and (iii) a one-point determination of the amount of unfrozen water. While Method 1 is accurate but requires the analysis of a high number of samples, Method 3 requires only one single sample, with a loss of accuracy. Method 2 works best taking sample preparation and accuracy into account. Various systems containing sugar (sucrose, trehalose) and other excipients (histidine buffer, phosphate buffer, sodium chloride, arginine hydrochloride, arginine citrate) were evaluated with different antibody concentrations to evaluate the composition of the maximally freeze concentrated solution. The freeze concentrates exhibited a water content of 20-30%, slightly dependent on the excipients, but independent of the antibody concentration. The methodology we developed is broadly applicable for the analysis of the composition of maximally freeze concentrated solutions and can help to elucidate protein stability during lyophilisation.

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