新規のc.2179T>C変異はPHEXタンパク質の細胞内輸送を阻害し、中国のある家族においてX-linked hypophosphatemic ricketsを引き起こした

A novel c.2179T>C mutation blocked the intracellular transport of PHEX protein and caused X-linked hypophosphatemic rickets in a Chinese family.

• Baowei Li
• Xiong Wang
• Xiaodan Hao
• Yanran Liu
• Yin Wang
• Chan Shan
• Xiang Ao
• Ying Liu
• HongChu Bao
• Peifeng Li

抄録

背景:

X-linked hypophosphatemic rickets（XLH）は、遺伝性の低リン酸血症性くる病（HR）の大部分を占める異種遺伝性のリン酸消耗性疾患である。XLHは、X染色体上に位置するリン酸調節エンドペプチダーゼ遺伝子（PHEX）の機能喪失変異によって引き起こされる。

BACKGROUND: X-linked hypophosphatemic rickets (XLH) is a heterogeneous genetic phosphate wasting disorder that occupies the majority of inheritable hypophosphatemic rickets (HR). XLH is caused by loss-of-function mutations in the phosphate-regulating endopeptidase gene (PHEX) located on the X chromosome.

方法:

本研究では、原因遺伝子を同定するために、プロブランドに対して全ゲノムシークエンシング（WES）を行った。突然変異は、PolyPhen-2などの予測オンラインソフトウェアを用いて解析した。候補遺伝子の野生型（WT）および変異型cDNAを含むプラスミドをHEK293にトランスフェクションし、ウエスタンブロット、免疫染色、エンドグリコシダーゼH消化により、候補タンパク質の発現、細胞内局在、およびグリコシル化状態を検出した。また、関連因子の発現および濃度をRT-PCRおよびELISAにより測定した。

METHOD: In this study, we performed whole-exome sequencing (WES) on the proband to identify the causative gene. The mutations were analyzed by predictive online software, such as PolyPhen-2. Plasmids containing the wild-type (WT) and mutant cDNA of the candidate gene were transfected into HEK293, then, the expression, cellular localization, and glycosylation state of the candidate proteins were detected by western blot, immunostaining, and endoglycosidase H digestion. The expression and concentration of related factor were measured by RT-PCR and ELISA.

結果:

我々は、PHEXにおいて、p.Phe727Leu（F727L）の置換をもたらす新規なミスセンス変異c.2179T>Cを同定した。この突然変異は、4つの予測オンラインソフトウェアのすべてで疾患の原因となることが予測された。インビトロ研究では、F727L置換は、変異体PHEXの細胞内トラフィッキングを妨げ、変異体PHEXタンパク質の〜59％が小胞体（ER）に保持され、変異体タンパク質の〜16％のみが細胞表面に局在していることが示された。エンドグリコシダーゼH消化アッセイは、変異体F727L PHEXタンパク質が完全にグリコシル化されていないことを示した。変異型PHEX群から採取したhFOB1.19細胞培養液中の無傷のFGF23の濃度は、WT群（32.1pg/ml）及び対照群（23.5pg/ml）と比較して最も高い（62.9pg/ml）であった。

RESULTS: We identified a novel missense mutation c.2179T>C in the PHEX that results in the substitution of p.Phe727Leu (F727L). This mutation was predicted to be disease-causing by all four predictive online software. In vitro studies demonstrated that the F727L substitution hindered the intracellular trafficking of the mutant PHEX, with ~59% of mutant PHEX protein retained in the endoplasmic reticulum (ER) and only ~16% of the mutant protein localized on the cell surface. Endoglycosidase H digestion assay showed that the mutant F727L PHEX protein was not fully glycosylated. The concentration of intact FGF23 in hFOB1.19 cell culture medium collected from the mutant PHEX group was the highest (62.9 pg/ml) compared to the WT group (32.1 pg/ml) and control group (23.5 pg/ml).

結論:

我々の結果は、変異型PHEXタンパク質が低グリコシル化されてER内で遅延していること、変異型PHEXタンパク質に起因する細胞培養液中のインタクトFGF23レベルがWT群に比べて有意に上昇していることを確認したことから、PHEXの1塩基変異がこの家族のXLH症候群を引き起こした理由を説明できるかもしれません。

CONCLUSION: Our results confirmed that the mutant PHEX protein was lowly glycosylated and retarded within the ER, the intact FGF23 level in cell culture media caused by the mutant PHEX protein was significantly elevated compared to that of the WT group, which may explain why the single base mutation in the PHEX led to XLH syndrome in this family.

© 2020 The Authors. Molecular Genetics & Genomic Medicine published by Wiley Periodicals LLC.