酵母二種混合スクリーニングによるSchistosoma japonicum GSK3β相互作用パートナーの同定と寄生虫生存に果たす役割

Identification of Schistosoma japonicum GSK3β interacting partners by yeast two-hybrid screening and its role in parasite survival.

• Jingyi Liu
• Huimin Li
• Tianqi Xia
• Pengfei Du
• Bikash Giri
• Xue Li
• Xuxin Li
• Guofeng Cheng

抄録

膠原病は、世界中に分布する一般的な感染症である片肺片肺炎の原因菌である。これまでのリン酸化プロテオーム解析から、真核生物に保存されているグリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK3）がSchistosoma japonicumのタンパク質リン酸化に関与している可能性が示唆されていた。本研究では、このGSK3β（SjGSK3β）の相互作用相手を同定し、寄生虫生存に果たす役割を評価することを目的とした。これらの目的のために、我々は、異なる発生段階におけるSjGSK3βの転写レベルを決定し、酵母の二種ハイブリッドS. japonicum cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、SjGSK3βの相互作用パートナーを同定した。さらに、RNA干渉（RNAi）を用いて、成虫におけるSjGSK3βの発現をin vitroで阻害し、その結果、SjGSK3βと相互作用すると考えられるタンパク質の転写とワームの生存率の変化を対照ワームと比較して調べた。逆転写-定量的ポリメラーゼ連鎖解析の結果、SjGSK3βはS. japonicumのライフサイクル全体で発現しており、卵での発現レベルが高く、雌ワームよりも雄ワームでの発現レベルが比較的高いことが明らかになった。酵母の２ハイブリットライブラリーをスクリーニングした結果、細胞分裂周期37ホモログ（Cdc37）、14-3-3タンパク質、テグメン抗原（I(H)A）、V-ATPaseプロテオリピドサブユニット、ミオシンアルカリ軽鎖1、および認識された機能ドメインを持たない３つのタンパク質を含む８つのタンパク質がSjGSK3βと相互作用する可能性があることが確認されました。さらに、SjGSK3β RNAiはSjGSK3β遺伝子の転写レベルを低下させ、キナーゼ活性、細胞生存率、ワーム生存率を有意に低下させた。以上のことから、SjGSK3βはパートナータンパク質と相互作用し、キナーゼ活性を調節することでミミズの生存に影響を与えている可能性が示唆された。

Schistosoma is the causative agent of schistosomiasis, a common infectious disease distributed worldwide. Our previous phosphoproteomic analysis suggested that glycogen synthase kinase 3 (GSK3), a conserved protein kinase in eukaryotes, is likely involved in protein phosphorylation of Schistosoma japonicum. Here, we aimed to identify the interacting partners of S. japonicum GSK3β (SjGSK3β) and to evaluate its role in parasite survival. Toward these ends, we determined the transcription levels of SjGSK3β at different developmental stages and identified its interacting partners of SjGSK3β by screening a yeast two-hybrid S. japonicum cDNA library. We further used RNA interference (RNAi) to inhibit the expression of SjGSK3β in adult worms in vitro and examined the resultant changes in transcription of its putative interacting proteins and in worm viability compared with those of control worms. Reverse transcription-quantitative polymerase chain analysis indicated that SjGSK3β is expressed throughout the life cycle of S. japonicum, with higher expression levels detected in the eggs and relatively higher expression level found in male worms than in female worms. By screening the yeast two-hybrid library, eight proteins were identified as potentially interacting with SjGSK3β including cell division cycle 37 homolog (Cdc37), 14-3-3 protein, tegument antigen (I(H)A), V-ATPase proteolipid subunit, myosin alkali light chain 1, and three proteins without recognized functional domains. In addition, SjGSK3β RNAi reduced the SjGSK3β gene transcript level, leading to a significant decrease in kinase activity, cell viability, and worm survival. Collectively, these findings suggested that SjGSK3β may interact with its partner proteins to influence worm survival by regulating kinase activity.