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カルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびアドレノメデュリン受容体へのGタンパク質のカップリングの生化学的特徴付けをネイティブPAGEアッセイを用いて行った | 日本語AI翻訳でPubMed論文検索 | WHITE CROSS 歯科医師向け情報サイト

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J. Biol. Chem..2020 Jul;295(28):9736-9751. RA120.013854. doi: 10.1074/jbc.RA120.013854.Epub 2020-06-02.

カルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびアドレノメデュリン受容体へのGタンパク質のカップリングの生化学的特徴付けをネイティブPAGEアッセイを用いて行った

Biochemical characterization of G protein coupling to calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin receptors using a native PAGE assay.

  • Amanda M Roehrkasse
  • Margaret L Warner
  • Jason M Booe
  • Augen A Pioszak
PMID: 32487746 DOI: 10.1074/jbc.RA120.013854.

抄録

カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、アドレノメデュリン(AM)、アドレノメデュリン2/インターメデュリン(AM2/IMD)は、血管拡張、心筋保護、疼痛伝達など、神経系、循環系において重複したユニークな機能を持っています。これらの作用は、クラスBカルシトニン様G蛋白質共役型受容体(CLR)によって媒介され、この受容体は、そのペプチドリガンド選択性を決定する3つの受容体活性修飾蛋白質(RAMP1-3)とヘテロ二量体化します。3つのアゴニストとRAMPがどのようにCLRとトランスデューサータンパク質との結合を調節するのかは、まだ十分に理解されていない。ここでは、我々は生化学的に各CLR-RAMP複合体へのアゴニストによって促進されたGタンパク質のカップリングを特徴付けた。哺乳類細胞で発現した洗浄剤可溶化蛍光タンパク質タグ付きCLR-RAMP複合体の形成と耐熱性を評価するために、ネイティブPAGE法を適応させた。アゴニストと精製されたGタンパク質サロゲートmini-G(mG)を添加すると、移動度がシフトしたアゴニスト-CLR-RAMP-mG四元錯体ゲルバンドが得られ、アンタゴニストに敏感であった。mG結合型受容体に対するアゴニストの見かけの親和性と、アゴニスト占有型受容体に対するmGの親和性を測定したところ、リガンドとRAMPの両方がmG結合を制御していることが明らかになり、CLRの細胞外ドメインと膜貫通ドメインのアゴニストの関与がトランスデューサーのリクルートにどのように影響するかが明らかになった。mini-Gおよび-Gキメラを用いて、各受容体についてmG>mG>mGのカップリングランクオーダーを観察した。最後に、我々は、ネイティブゲルアッセイがAMおよびAM2/IMDキメラのcAMPシグナル伝達力を予測できることを示すことによって、ネイティブゲルアッセイの生理学的関連性を実証した。これらの結果は、膜タンパク質生化学のためのネイティブ PAGE アッセイの力を強調し、CGRP、AM、AM2/IMD の共有された、そして異なるシグナル伝達特性の分子基盤を理解するための生化学的基盤を提供します。

Calcitonin gene-related peptide (CGRP), adrenomedullin (AM), and adrenomedullin 2/intermedin (AM2/IMD) have overlapping and unique functions in the nervous and circulatory systems including vasodilation, cardioprotection, and pain transmission. Their actions are mediated by the class B calcitonin-like G protein-coupled receptor (CLR), which heterodimerizes with three receptor activity-modifying proteins (RAMP1-3) that determine its peptide ligand selectivity. How the three agonists and RAMPs modulate CLR binding to transducer proteins remains poorly understood. Here, we biochemically characterized agonist-promoted G protein coupling to each CLR·RAMP complex. We adapted a native PAGE method to assess the formation and thermostabilities of detergent-solubilized fluorescent protein-tagged CLR·RAMP complexes expressed in mammalian cells. Addition of agonist and the purified G protein surrogate mini-G (mG) yielded a mobility-shifted agonist·CLR·RAMP·mG quaternary complex gel band that was sensitive to antagonists. Measuring the apparent affinities of the agonists for the mG-coupled receptors and of mG for the agonist-occupied receptors revealed that both ligand and RAMP control mG coupling and defined how agonist engagement of the CLR extracellular and transmembrane domains affects transducer recruitment. Using mini-G and -G chimeras, we observed a coupling rank order of mG > mG > mG for each receptor. Last, we demonstrated the physiological relevance of the native gel assays by showing that they can predict the cAMP-signaling potencies of AM and AM2/IMD chimeras. These results highlight the power of the native PAGE assay for membrane protein biochemistry and provide a biochemical foundation for understanding the molecular basis of shared and distinct signaling properties of CGRP, AM, and AM2/IMD.

© 2020 Roehrkasse et al.