ATRAによるラットVSMCs遊走の調節におけるZFP580の役割とそのメカニズム

[The role of ZFP580 in the regulation of rat VSMCs migration by ATRA and its mechanism].

• Guo-Dong Wu
• Kai Chen
• Jing-Jing Zhang
• Shu-Ping Wei
• Mei Zhang
• Wen-Cheng Zhang

抄録

目的:

新規C2H2ジンクフィンガー転写因子ZFP580の全トランスレチノイン酸(ATRA)によるVSMCs遊走の調節における役割とその基礎となるメカニズムを調べること。

OBJECTIVE: To investigate the probable roles of the novel C2H2 zinc finger transcription factor ZFP580 on all-transretinoic acid (ATRA)-regulated VSMCs migration and underlying mechanisms.

方法:

ラット大動脈VSMCsを単離し、培養し、同定した。VSMCsを0、5、10または20μmol/Lの濃度のATRAで24時間処理した。各群でVSMCsの遊走能を観察し、0μmol/LのATRAで処理した対照群と比較した。ZFP580のmRNAおよびタンパク質発現量をQPCRおよびウェスタンブロットにより検出した。ERK阻害剤PD98059を用いてERKのタンパク質発現を阻害した場合、ATRA刺激下でVSMCにおけるZFP580タンパク質発現が検出された。アデノウイルストランスフェクション技術を用いて、ZFP580の過剰発現または低発現のVSMCsを得、QPCRおよびウェスタンブロットを用いて、MMP-2、MMP-9およびZFP580のmRNAおよびタンパク質レベルを検出した。

METHODS: Rat aortic VSMCs were isolated, cultured and identified. VSMCs were treated with ATRA at the concentrations of 0, 5, 10 or 20 μmol/L for 24 hours. The migration ability of VSMCs was observed in each group and compared with control group which was treated by 0 μmol/L ATRA. The mRNA and protein expression levels of ZFP580 were detected by QPCR and Western blot. ZFP580 protein expression in VSMCs was detected under ATRA stimulation when ERK inhibitor PD98059 was used to inhibit the protein expression of ERK. Adenovirus transfection technology was used to obtain VSMCs with overexpression or low expression of ZFP580, and QPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein levels of MMP-2, MMP-9 and ZFP580.

結果:

VSMCsの培養10日目に免疫蛍光を測定したところ、平滑筋細胞の特異的マーカーであるSM22α抗体が陽性であった。コントロール群と比較して、5、10、20μmol/L ATRA前処理群では、VSMCsの遊走が32％、43％、59％減少した。コントロール群と比較して、20μmol/L ATRAで処理したVSMCsは、24時間、48時間および72時間で49％、36％および22％の細胞遊走を減少させた。 ZFP580のmRNAおよびタンパク質発現レベルは、ATRA刺激溶解度の増加および刺激時間の延長に伴い増加した。ERKはATRA刺激の15分後に有意に増加した。ERK阻害剤PD98059（20μmol/L）で前処理すると、ERKタンパク質の発現が阻害され、ATRA誘発ZFP580タンパク質の発現が減少した。ZFP580の過剰発現はMMP-2およびMMP-9の発現を抑制し、ZFP580のダウン発現はMMP-2およびMMP-9の発現を促進した。

RESULTS: On the 10th day of VSMCs culture, immunofluorescence showed that SM22 alpha antibody, as a specific marker of smooth muscle cells, was positive. Compared to the control group, VSMCs migration was reduced by 32%, 43%, and 59% in the group of 5, 10, and 20 μmol/L ATRA pretreatment. Compared with the control group, VSMCs treated by 20 μmol/L ATRA reduced the cell migration by 49%, 36% and 22% at 24, 48 and 72 h. The mRNA and protein expression levels of ZFP580 were increased with the increase of ATRA stimulation solubility and the extension of stimulation time. ERK was increased significantly after 15 min of ATRA stimulation. Pretreatment with ERK inhibitor PD98059 (20 μmol/L) inhibited the expression of ERK protein and reduced the expression of ATRA-induced ZFP580 protein. Overexpression of ZFP580 inhibited the expressions of MMP-2 and MMP-9, whereas down-expression of ZFP580 promoted the expressions of MMP-2 and MMP-9.

結論:

ATRAはERKシグナル伝達経路を介してZFP580の発現を増加させ、ZFP580は下流のMMP-2およびMMP-9の発現に影響を与えることで、ATRAのVSMCs移行阻害に関与していた。

CONCLUSION: ATRA increased the expression of ZFP580 through the ERK signaling pathway, while ZFP580 was involved in ATRA's inhibition of VSMCs migration by affecting the expression of downstream MMP-2 and MMP-9.