ホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXは、カリウムチャネルTHIK-1を細胞外から遮断する

The phosphodiesterase inhibitor IBMX blocks the potassium channel THIK-1 from the extracellular side.

• Xinle Zou
• Linus J Conrad
• Kristin Koschinski
• Günter Schlichthörl
• Regina Preisig-Müller
• Eugen Netz
• Jens Krüger
• Jürgen Daut
• Vijay Renigunta

抄録

ツーポアドメインカリウムチャネル（Kチャネル）THIK-1は、プロテインキナーゼA（PKA）の予測されるいくつかのリン酸化部位を有している。THIK-1がPKAを介して制御されているかどうかを解明するために、我々は哺乳類細胞株（CHO細胞）でTHIK-1チャネルを発現させ、PKAの活性化を誘導する薬理学的ツールとしてホスホジエステラーゼ阻害剤3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）を使用しました。全細胞パッチクランプ記録を用いて、IBMXを120μMのICで適用することにより、THIK-1の電流が抑制されることを発見した。驚くべきことに、IBMXまたはパッチピペットを介したセカンドメッセンジャーcAMPの細胞内適用は、THIK-1電流に影響を与えませんでした。対照的に、IBMXの細胞外適用はTHIK-1を迅速かつ可逆的に阻害した。アウトサイドアウトパッチを用いたパッチクランプ実験では、THIK-1電流もIBMXの細胞外適用によって阻害された。卵母細胞におけるTHIK-1チャネルの発現は、野生型チャネルと変異チャネルを比較するために使用された。その結果、PKAリン酸化部位の変異はTHIK-1電流に対するIBMXの抑制効果に変化を与えなかった。ＴＨＩＫ-１の（細胞外の）ヘリカルキャップのすべての残基の変異解析は、Ｃ２-Ｐ１リンカーにある９２位のアルギニン残基の変異が、ＩＢＭＸの抑制効果を著しく低下させることを示した。この柔軟性のあるリンカー領域は、各Kチャネルのサブタイプに特有のものであり、チャネル特異的なブロッカーの標的となる可能性がある。

The two-pore-domain potassium channel (K channel) THIK-1 has several predicted protein kinase A (PKA) phosphorylation sites. In trying to elucidate whether THIK-1 is regulated via PKA we expressed THIK-1 channels in a mammalian cell line (CHO cells) and used the phosphodiesterase inhibitor 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX) as a pharmacological tool to induce activation of PKA. Using the whole-cell patch-clamp recording we found that THIK-1 currents were inhibited by application of IBMX with an IC of 120 µM. Surprisingly, intracellular application of IBMX or of the second messenger cAMP via the patch pipette had no effect on THIK-1 currents. In contrast, extracellular application of IBMX produced a rapid and reversible inhibition of THIK-1. In patch-clamp experiments with outside-out patches, THIK‑1 currents were also inhibited by extracellular application of IBMX. Expression of THIK-1 channels in oocytes was used to compare wild-type channels with mutated channels. Mutation of the putative PKA phosphorylation sites did not change the inhibitory effect of IBMX on THIK-1 currents. Mutational analysis of all residues of the (extracellular) helical cap of THIK-1 showed that mutation of the arginine residue at position 92, which is in the C2-P1 linker, markedly reduced the inhibitory effect of IBMX. This flexible linker region, which is unique for each K channel subtype, may be a possible target of channel-specific blockers.

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