マングローブクラブGoniopsis cruentata（Brachyura, Grapsidae）のエラにおける（Na, K）-ATPase活性の生化学的特性とマグネシウムによるアロステリックな調節

Biochemical Characterization and Allosteric Modulation by Magnesium of (Na, K)-ATPase Activity in the Gills of the Red Mangrove Crab Goniopsis cruentata (Brachyura, Grapsidae).

• Cintya M Moraes
• Malson N Lucena
• Daniela P Garçon
• Marcelo R Pinto
• Leonardo M Fabri
• Rogério O Faleiros
• Carlos F L Fontes
• John C McNamara
• Francisco A Leone

抄録

本研究では、グラップシッドクラブGoniopsis cruentataの鰓後小体画分における(Na,K)-ATPase活性の速度論的特性を明らかにした。(Na,K)-ATPase活性は全ATPase活性の95%を占めており、ショ糖密度遠心分離により、ショ糖25～35%の間にATPase活性のピークが見られ、部分的に分離された2つのタンパク質画分に分布していることがわかった。(Na、K)-ATPaseα-サブユニットは、電離細胞の細胞質全体に局在し、≈10kDaのMを持っており、協調的な速度論に従うATPを加水分解します。その結果、低濃度(V=186.0±9.3nmol Pi min mg protein, K=0.085±0.004mmol L)と高濃度(V=153.4±7.7nmol Pi min mg protein, K=0.013±0.0006mmol L)の親和性ATP結合部位の特徴を明らかにした。低ATP濃度では、過剰なMgが酵素を刺激し、(Na, K)-ATPase活性の50%を占める高親和性結合部位の露出を誘発する。Mg（V=425.9±25.5nmolPiminmgタンパク質、K=0.16±0.01mmol L）、K（V=485.3±24.3nmolPiminmgタンパク質、K=0.9±0.05mmolL）、Na（V=425.0±0.05mmolL）による刺激は、酵素の活性の50％を占める高親和性結合部位の露出を誘発する。0±23.4nmol Pi minmg protein, K=5.1±0.3mmol L）とNH（V=497.9±24.9nmol Pi minmg protein, K=9.7±0.5mmolL）は協調的な速度論に従う。ウアバインは、K=196.6±9.8μmolLでATPアーゼ活性の95％まで阻害する。このように、Goniopsis cruentataの鰓(Na, K)-ATPaseの速度論的特性を初めて明らかにしたことで、この半陸性マングローブ蟹の浸透調節能力の生化学的基盤をよりよく理解することができた。

We provide a kinetic characterization of (Na, K)-ATPase activity in a posterior gill microsomal fraction from the grapsid crab Goniopsis cruentata. (Na, K)-ATPase activity constitutes 95% of total ATPase activity, and sucrose density centrifugation reveals an ATPase activity peak between 25 and 35% sucrose, distributed into two, partially separated protein fractions. The (Na, K)-ATPase α-subunit is localized throughout the ionocyte cytoplasm and has an M of ≈ 10 kDa and hydrolyzes ATP obeying cooperative kinetics. Low (V = 186.0 ± 9.3 nmol Pi min mg protein and K = 0.085 ± 0.004 mmol L) and high (V = 153.4 ± 7.7 nmol Pi min mg protein and K = 0.013 ± 0.0006 mmol L) affinity ATP binding sites were characterized. At low ATP concentrations, excess Mg stimulates the enzyme, triggering exposure of a high-affinity binding site that accounts for 50% of (Na, K)-ATPase activity. Stimulation by Mg (V = 425.9 ± 25.5 nmol Pi min mg protein, K = 0.16 ± 0.01 mmol L), K (V = 485.3 ± 24.3 nmol Pi min mg protein, K = 0.9 ± 0.05 mmol L), Na (V = 425.0 ± 23.4 nmol Pi min mg protein, K = 5.1 ± 0.3 mmol L) and NH (V = 497.9 ± 24.9 nmol Pi min mg protein, K = 9.7 ± 0.5 mmol L) obeys cooperative kinetics. Ouabain inhibits up to 95% of ATPase activity with K = 196.6 ± 9.8 µmol L. This first kinetic characterization of the gill (Na, K)-ATPase in Goniopsis cruentata enables better comprehension of the biochemical underpinnings of osmoregulatory ability in this semi-terrestrial mangrove crab.