ヒトアポリポ蛋白質の大規模プロファイリングのためのハイスループット質量分析ベースのアッセイ

A high-throughput mass spectrometry-based assay for large-scale profiling of circulating human apolipoproteins.

• Valentin Blanchard
• Damien Garçon
• Catherine Jaunet
• Kevin Chemello
• Stéphanie Billon-Crossouard
• Audrey Aguesse
• Aya Garfa
• Gilles Famchon
• Amada Torres
• Cédric Le May
• Matthieu Pichelin
• Edith Bigot-Corbel
• Gilles Lambert
• Bertrand Cariou
• Samy Hadjadj
• Michel Krempf
• Kalyane Bach-Ngohou
• Mikaël Croyal

抄録

アポリポ蛋白質はリポ蛋白質の代謝を制御しており、代謝性疾患や心血管疾患の有望なバイオマーカーとなっています。アポリポ蛋白質の定量と表現型解析は、イムノアッセイとは異なり、MSでは複数のアポリポ蛋白質の定量と表現型解析が可能である。そこで、ここでは、18種類のヒトアポリポ蛋白質[A-I、A-II、A-IV、A-V、B48、B100、C-I、C-II、C-III、C-IV、D、E、F、H、J、L1、M、（a）]を同時に定量できるLC-MS/MSアッセイを開発し、ヒト血漿および血清サンプル中のapoE、apoL1、およびapo（a）の表現型を決定することを目的とした。血漿および血清アポリポ蛋白質を最適化された手順でトリプシン消化し、ペプチドを抽出し、LC-MS/MSで分析した。この方法は、既知のペプチド量でスパイクされたサンプルにおいて、標準的なガイドラインに従って検証された。LC-MS/MSの結果を他の技術で得られたものと比較し、再現性、希釈効果、安定性も評価しました。ペプチドマーカーは、標的化されたアポリポ蛋白質の定量と表現型の選択に成功しました。最適化後、アッセイは直線性、定量下限、精度（バイアス：-14.8%～12.1%）、アッセイ内変動［変動係数（CVs）：1.5～14.2%］、およびアッセイ間の再現性（CVs：4.1～14.3%）について検証されました。Bland-Altmanプロットは、LC-MS/MSと他の手法との間に大きな統計的に有意な差はないことを示した。LC-MS/MSの結果は5回の繰り返し実験で再現性があり（CVs：1.8～13.7％）、血漿検体と血清検体の間で顕著な差が認められました。今回開発したLC-MS/MS測定法は、迅速で、少量のサンプリングで済み、コストもリーズナブルであるため、アポリポ蛋白質代謝の幅広い研究に適用可能である。また、本測定法がどのように実験室で実施できるかについても紹介する。

Apolipoproteins govern lipoprotein metabolism and are promising biomarkers of metabolic and cardiovascular diseases. Unlike immunoassays, MS enables the quantification and phenotyping of multiple apolipoproteins. Hence, here, we aimed to develop a LC-MS/MS assay that can simultaneously quantitate 18 human apolipoproteins [A-I, A-II, A-IV, A-V, B48, B100, C-I, C-II, C-III, C-IV, D, E, F, H, J, L1, M, and (a)] and determined apoE, apoL1, and apo(a) phenotypes in human plasma and serum samples. The plasma and serum apolipoproteins were trypsin digested through an optimized procedure and peptides were extracted and analyzed by LC-MS/MS. The method was validated according to standard guidelines in samples spiked with known peptide amounts. The LC-MS/MS results were compared with those obtained with other techniques, and reproducibility, dilution effects, and stabilities were also assessed. Peptide markers were successfully selected for targeted apolipoprotein quantification and phenotyping. After optimization, the assay was validated for linearity, lower limits of quantification, accuracy (biases: -14.8% to 12.1%), intra-assay variability [coefficients of variation (CVs): 1.5-14.2%], and inter-assay repeatability (CVs: 4.1-14.3%). Bland-Altman plots indicated no major statistically significant differences between LC-MS/MS and other techniques. The LC-MS/MS results were reproducible over five repeated experiments (CVs: 1.8-13.7%), and we identified marked differences among the plasma and serum samples. The LC-MS/MS assay developed here is rapid, requires only small sampling volumes, and incurs reasonable costs, thus making it amenable for a wide range of studies of apolipoprotein metabolism. We also highlight how this assay can be implemented in laboratories.

Copyright © 2020 Blanchard et al.