MALDI-TOF MSのための新しい迅速なサンプル調製法は、Sensu Latoの種と単離分化を可能にします

A Novel Rapid Sample Preparation Method for MALDI-TOF MS Permits Sensu Lato Species and Isolate Differentiation.

• Anna-Cathrine Neumann-Cip
• Volker Fingerle
• Gabriele Margos
• Reinhard K Straubinger
• Evelyn Overzier
• Sebastian Ulrich
• Andreas Wieser

抄録

この属は、人や動物の健康に深刻な影響を及ぼす可能性のあるベクトル媒介性の細菌性病原体で構成されています。sensu lato種複合体のメンバーは、北半球で最も一般的な媒介性疾患の一つであるライムボレリア症を引き起こす可能性があります。また、スピロヘータの再燃熱グループのメンバーは、熱帯・亜熱帯・温帯地域の動物にマダニを媒介とする再燃熱や様々な発熱性疾患を引き起こす可能性があります。現在、ボレリアの同定は、主にPCR法やDNA配列決定法を用いて行われていますが、複雑なDNAテンプレートを用いているため、複雑で手間がかかる上に、比較的高価なものとなっています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）のような代替技術は、微生物診断室での細菌の迅速な同定のために現在最も使用されている技術の1つであるにもかかわらず、pp.については十分に確立されていません。これは主に、簡単な試料調製法や培地汚染によるマススペクトルの不明瞭化によって得られる結果に満足できないことが原因です。さらに、spp. MALDI-TOF MSのための包括的なライブラリはまだ確立されていない。本研究では、MALDI-TOF MSにおいて、1スポットあたり10万以下の細菌から高品質のspp.スペクトルを測定することを可能にする新しいフィルターベースの化学抽出技術を開発した。13 種類の異なる種の 49 個の分離株を使用して、これまでで最大の spp.の大量ライブラリーを作成し、プロトコルを検証しました。このライブラリは無事に確立され、使用された分離株の96%以上を種レベルまで正確に同定することができました。その結果、ほとんどの分離株で緊密なクラスターを生成することができました。このクラスターの生成結果を、連結された多座配列タイピング遺伝子に基づく系統樹と比較したところ、驚くほどの相同性が得られた。我々のデータは、ここで述べた技術が、ボレリア複合体内の種と株のタイピングに迅速かつ信頼性の高い方法で使用できることを示している。

The genus comprises vector-borne bacterial pathogens that can severely affect human and animal health. Members of the sensu lato species complex can cause Lyme borreliosis, one of the most common vector-borne diseases in the Northern hemisphere. Besides, members of the relapsing fever group of spirochetes can cause tick-borne relapsing fever in humans and various febrile illnesses in animals in tropical, subtropical and temperate regions. spp. organisms are fastidious to cultivate and to maintain , and therefore, difficult to work with in the laboratory. Currently, borrelia identification is mainly performed using PCR and DNA sequencing methods, which can be complicated/frustrating on complex DNA templates and may still be relatively expensive. Alternative techniques such as matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) are not well established for spp., although this technique is currently one of the most used techniques for rapid identification of bacteria in microbiological diagnostic laboratories. This is mainly due to unsatisfactory results obtained by use of simple sample preparation techniques and medium-contamination obscuring the mass spectra. In addition, comprehensive libraries for spp. MALDI-TOF MS have yet to be established. In this study, we developed a new filter-based chemical extraction technique that allows measurement of high quality spp. spectra from less than 100,000 bacteria per spot in MALDI-TOF MS. We used 49 isolates of 13 different species to produce the largest mass-library for spp. so far and to validate the protocol. The library was successfully established and identifies >96% of used isolates correctly to species level. Cluster analysis on the sum spectra was applied to all the different isolates, which resulted in tight cluster generation for most species. Comparative analysis of the generated cluster to a phylogeny based on concatenated multi-locus sequence typing genes provided a surprising homology. Our data demonstrate that the technique described here can be used for fast and reliable species and strain typing within the borrelia complex.

Copyright © 2020 Neumann-Cip, Fingerle, Margos, Straubinger, Overzier, Ulrich and Wieser.