His-tagged Peptidiscs を使用した膜プロテオームのアフィニティ精製により、下流の質量分析分析が可能になりました

His-Tagged Peptidiscs Enable Affinity Purification of the Membrane Proteome for Downstream Mass Spectrometry Analysis.

• John William Young
• Irvinder Singh Wason
• Zhiyu Zhao
• David G Rattray
• Leonard J Foster
• Franck Duong Van Hoa

抄録

質量分析 (MS) を用いた統合膜プロテオームの特性評価は、その複雑さと固有の不溶性のため、依然として困難な課題となっています。典型的な実験では、細胞膜を分離し、タンパク質を可溶化して分画し、MS分析の前に洗浄剤ミセルを除去します。しかし、洗浄剤は質量分析との相性が悪く、生物学的サンプルから洗浄剤を除去すると、タンパク質の同定が低下することがよくあります。洗剤に代わる方法として、我々は最近、細胞エンベロープのプロテオームを水溶性粒子に巻き込むことを可能にするペプチドディスク膜ミメティックを開発した。ここでは、我々は、アフィニティークロマトグラフィーによって再構成膜プロテオームを濃縮するためにペプチディスクペプチド足場のHisタグ付きバージョンを採用しています。この精製ステップは、リボソームや可溶性タンパク質を枯渇させることにより、サンプルの複雑さを軽減することができます。その結果、ペプチディスクライブラリーには、膜蛋白質が多く含まれていることが分かりました。この方法を用いて、Secトランスロコンの補助サブユニットであるSecDFyajC複合体の枯渇に伴う膜プロテオームの変化を調査した。枯渇株では、モーターATPase SecAの膜局在化が増加し、膜内タンパク質YibNのレベルが増加していることが明らかになった。これらの結果は、膜タンパク質のグローバルな精製や膜プロテオームの変化をモニターするためのペプチディスクの有用性を示している。

Characterization of the integral membrane proteome by mass spectrometry (MS) remains challenging due its high complexity and inherent insolubility. In a typical experiment, the cellular membranes are isolated, the proteins are solubilized and fractionated, and the detergent micelles are removed before MS analysis. Detergents are not compatible with mass spectrometry, however, and their removal from biological samples often results in reduced protein identification. As an alternative to detergents, we recently developed the peptidisc membrane mimetic, which allows entrapment of the cell envelope proteome into water-soluble particles, termed a "peptidisc library". Here, we employ a His-tagged version of the peptidisc peptide scaffold to enrich the reconstituted membrane proteome by affinity chromatography. This purification step reduces the sample complexity by depleting ribosomal and soluble proteins that often cosediment with cellular membranes. As a result, the peptidisc library is enriched in low-abundance membrane proteins. We apply this method to survey changes in the membrane proteome upon depletion of the SecDFyajC complex, the ancillary subunit of the Sec translocon. In the depleted strain, we detect increased membrane localization of the motor ATPase SecA, along with increased levels of an unannotated inner membrane protein, YibN. Together, these results demonstrate the utility of the peptidisc for global purification of membrane proteins and for monitoring change in the membrane proteome.