カルシウムフリーおよびサイトカラシンB処理は、逐次エレクトロポレーションによるフロックスマウス作製のための2細胞期胚におけるブラストメア融合を阻害する

Calcium-Free and Cytochalasin B Treatment Inhibits Blastomere Fusion in 2-Cell Stage Embryos for the Generation of Floxed Mice via Sequential Electroporation.

• Takuro Horii
• Ryosuke Kobayashi
• Mika Kimura
• Sumiyo Morita
• Izuho Hatada

抄録

Cre-loxPシステムを用いた条件付きノックアウトマウスの作製は、遺伝子の機能解析に有利である。2つのloxP部位を有する（floxed）マウスは、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いて受精卵から直接得ることができる。私たちは以前、1細胞の胚発生段階と2細胞の胚発生段階でエレクトロポレーション（EP）による各loxP部位の逐次ノックイン（KI）を行うと、同時KIと比較してfloxed対立遺伝子を持つマウスの数が増加することを報告しました。しかし、2細胞期のEPでは胚盤胞融合が頻繁に誘発された。これらの融合胚は4倍体化しているため、成育には至らない。本研究では、2細胞期のEPによる胚盤胞融合を阻害するために、以下の3つの条件を検討した。(1)ハイパートニック処理、(2)カルシウム(Ca)フリー処理、(3)アクチン重合阻害の3つの条件で検討した。2細胞期胚を高張処理することにより、胚盤胞融合が抑制され、胚盤胞の発生が促進されたが、KI効率が低下した。また，Caフリー処理やシトカラシンB（CB）によるアクチン重合阻害処理は，融合率を低下させ，胚盤胞の発生やKI効率に悪影響を及ぼさなかった。これらの結果から、2細胞期でのCaフリー処理やCB処理は、逐次EP法と組み合わせてフロックスマウスを作製するのに有効であることが示唆された。

The generation of conditional knockout mice using the Cre-loxP system is advantageous for the functional analysis of genes. Flanked by two loxP sites (floxed) mice can be directly obtained from fertilized eggs by the CRISPR/Cas9 genome editing system. We previously reported that sequential knock-in (KI) of each loxP site by electroporation (EP) at the 1- and 2-cell embryonic stages increases the number of mice with floxed alleles compared with simultaneous KI. However, EP at the 2-cell stage frequently induced blastomere fusion. These fused embryos cannot develop to term because they are tetraploidized. In this study, we examined the following three conditions to inhibit blastomere fusion by EP at the 2-cell stage: (1) hypertonic treatment, (2) Calcium (Ca)-free treatment, and (3) actin polymerization inhibition. Hypertonic treatment of 2-cell stage embryos prevented blastomere fusion and facilitated blastocyst development; however, KI efficiency was decreased. Ca-free treatment and actin polymerization inhibition by cytochalasin B (CB) reduced fusion rate, and did not have negative effects on development and KI efficiency. These results suggest that Ca-free and CB treatment at the 2-cell stage is effective to generate floxed mice in combination with a sequential EP method.