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肉芽腫様サルコイドーシスモデルにおけるp-CREB発現を介したα-MSHの抗炎症作用
Anti-inflammatory effects of α-MSH through p-CREB expression in sarcoidosis like granuloma model.
PMID: 32350353 PMCID: PMC7190699. DOI: 10.1038/s41598-020-64305-9.
抄録
α-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）は抗炎症作用を有するメラノコルチンシグナルペプチドである。我々は、α-MSHの効果を新しいin vitroサルコイドーシスモデルで評価することを目的とした。治療歴のないサルコイドーシス患者由来の末梢血単核球（PBMC）をマイコバクテリウム・アブセスス細胞壁から生成した微粒子でチャレンジすることにより、インビトロサルコイドーシス様肉芽腫モデルを開発しました。未チャレンジのPBMCと発生した肉芽腫を10μMのα-MSHまたは生理食塩水で毎日処理した。培養上清および細胞抽出物中のサイトカイン濃度を、それぞれイルミナマルチプレックスエリサおよびウエスタンブロットを用いて測定した。遺伝子発現はRNA-SeqおよびRT-PCRを用いて解析した。IL-7、IL-7R、IFN-γ、MC1R、NF-κB、リン酸化NF-κB（p-NF-κB）、MARCO、およびp-CREBのタンパク質分泌および遺伝子発現をウエスタンブロットおよびRNAseqを用いて測定した。発達した肉芽腫では、微小粒子のないPBMCと比較して、IL-7、IL-7R、およびIFN-γタンパク質の発現が有意に増加していた。IL-7、IL-7R、およびIFN-γタンパク質発現は、生理食塩水処理した肉芽腫と比較して、α-MSHに曝露した後、発達した肉芽腫で有意に減少した。微小粒子未チャレンジのPBMCsと比較して、全NF-κBおよびp-NF-κBは発達した肉芽腫で有意に増加したが、p-CREBの発現は変化しなかった。α-MSHの投与により、肉芽腫中のp-CREB濃度が有意に上昇した。α-MSHの抗炎症作用はp-CREBを特異的に阻害することで阻害された。 α-MSHはこのin vitro肉芽腫モデルにおいて抗炎症作用を有しており、これはCREBのリン酸化誘導を介した効果である。
Lung inflammation due to sarcoidosis is characterized by a complex cascade of immunopathologic events, including leukocyte recruitment and granuloma formation. α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) is a melanocortin signaling peptide with anti-inflammatory properties. We aimed to evaluate the effects of α-MSH in a novel in vitro sarcoidosis model. An in vitro sarcoidosis-like granuloma model was developed by challenging peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from patients with confirmed treatment-naïve sarcoidosis with microparticles generated from Mycobacterium abscessus cell walls. Unchallenged PBMCsand developed granulomas were treated daily with 10 μM α-MSH or saline as control. Cytokine concentrations in supernatants of culture and in cell extracts were measured using Illumina multiplex Elisa and western blot, respectively. Gene expression was analyzed using RNA-Seq and RT-PCR. Protein secretion and gene expression of IL-7, IL-7R, IFN-γ, MC1R, NF-κB, phosphorylated NF-κB (p-NF-κB), MARCO, and p-CREB were measured with western blot and RNAseq. A significant increase in IL-7, IL-7R, and IFN-γ protein expression was found in developed granulomas comparing to microparticle unchallenged PBMCs. IL-7, IL-7R, and IFN-γ protein expression was significantly reduced in developed granulomas after exposure to α-MSH compared with saline treated granulomas. Compared with microparticle unchallenged PBMCs, total NF-κB and p-NF-κB were significantly increased in developed granulomas, while expression of p-CREB was not changed. Treatment with α-MSH promoted a significantly higher concentration of p-CREB in granulomas. The anti-inflammatory effects of α-MSH were blocked by specific p-CREB inhibition. α-MSH has anti-inflammatory properties in this in vitro granuloma model, which is an effect mediated by induction of phosphorylation of CREB.