酸素制限条件下での化学自動増殖とPHB産生を改善するためのCupriavidus necator H16の代謝工学

Metabolic engineering of Cupriavidus necator H16 for improved chemoautotrophic growth and PHB production under oxygen-limiting conditions.

• Ruohao Tang
• Caihong Weng
• Xiaowei Peng
• Yejun Han

抄録

C. necator H16では、酸素制限条件下での生育が制限されながらも、Ployhydroxybutyrate(PHB)の蓄積が促進されます。二酸化炭素、水素、酸素を基質とする自己栄養培養下では、混合物中の酸素濃度が6.9%(v/v)以下であれば安全な条件と考えられる。また、C. necator H16 の酸素制限条件下では、細胞の急速な増殖と PHB の大量蓄積を同時に達成することが期待されている。本研究では、トランスクリプトーム解析に基づいて、酸素制限条件下での細胞の急速成長と PHB の大量蓄積を同時に達成することが可能な代謝工学的遺伝子組み換え株を構築した。比較トランスクリプトーム解析の結果、C. necator H16 の自家培養におけるエネルギー産生に関連する遺伝子は、酸素制限条件下（3%, v/v）でダウンレギュレーションされていた。また、PHB生合成経路の主要中間体(ピルビン酸及びアセチル-CoA)代謝に関連する遺伝子を解析した。そのうち、L-乳酸脱水素酵素、イソクエン酸リアーゼ、アセテートキナーゼをコードする遺伝子ldh, iclA, ackA2は酸素制限条件下(3%, v/v)でアップレギュレーションされたが、ほとんどの遺伝子はダウンレギュレーションされていた。Vitreoscillaヘモグロビン（VHb）は、好気性代謝とエネルギー生成を促進する能力を有している。酸素制限条件下でのC. necator H16における細菌の増殖を促進し、エネルギー生成を改善するために、最適化されたプロモーターPを用いてVHb遺伝子をC. necator H16に導入し、さらに、膜結合型ヒドロゲナーゼ（MBH）シグナルペプチドの牽引によりVHbを細菌のペリプラズム空間に局在させた。異なる遺伝子のノックアウトを最適化することで、ldhをノックアウトすることでPHB産生が改善され、副産物が減少することがわかった。最後に、C. necator H16において、vgbとldhをノックアウトした組換え株Reh01(p2M-pj-v)を異種発現させることにより、C. necator H16を構築した。その結果、酸素制限条件下(3%, v/v)での対照株(Reh(p2)と比較して、Reh01(p2M-pj-v)の乾燥細胞重量(DCW)は31.0%、PHB含量は30.9%、PHB産生量は71.5%増加し、また、Reh01(p2M-pj-v)の乾燥細胞重量(DCW)は30.9%増加し、PHB産生量は71.5%増加した。本研究は、トランスクリプトームと代謝工学の観点から、C. necatorにおいて、酸素制限下や自己栄養条件下での急速な細胞増殖と大きなPHB蓄積を達成するための新たなアイデアを提供するものである。

The oxygen-limiting condition promotes the accumulation of ployhydroxybutyrate (PHB) in C. necator H16, while the growth of which is restricted. Under autotrophic culture using carbon dioxide, hydrogen, and oxygen as substrates, the oxygen concentration below 6.9% (v/v) in the mixture is considered as a safe condition. It also expected to achieve cell rapid growth and large accumulation of PHB simultaneously under the oxygen-limiting condition in C. necator H16. In this study, a metabolically engineered strain capable of both rapid growth and large accumulation of PHB under oxygen-limiting conditions was constructed based on the transcriptomic analysis. In the comparative transcriptomic analysis, the genes related to energy-generating of C. necator H16 at autotrophic culture were downregulated under oxygen-limiting conditions (3%, v/v). Besides, the genes related to the key intermediates (pyruvate and acetyl-CoA) metabolism in PHB biosynthetic pathway were analyzed. Most of which were downregulated, except the genes ldh, iclA, and ackA2 respectively encoding L-lactate dehydrogenase, isocitrate lyase, and acetate kinase were upregulated under oxygen-limiting conditions (3%, v/v). The Vitreoscilla hemoglobin (VHb) has the ability to promote aerobic metabolism and energy generation. To promote the bacterium growth and improve the energy generation in C. necator H16 under oxygen-limiting conditions, the VHb gene was introduced into C. necator H16 with the optimized promoter P. Moreover, VHb was localized to the periplasmic space of the bacterium by the traction of membrane-bound hydrogenase (MBH) signal peptide. By optimizing the knockout of different genes, it was found that knockout of ldh can improve PHB production and reduce the by-products. Finally, a recombinant strain Reh01 (p2M-pj-v) was constructed by heterologous expression of vgb and ldh knockout in C. necator H16. Compared with the control (Reh (p2)) under oxygen-limiting conditions (3%, v/v), the dry cell weight (DCW), PHB content, and PHB production of Reh01 (p2M-pj-v) increased by 31.0%, 30.9%, and 71.5%, respectively. From the perspectives of transcriptome and metabolic engineering, the work provides new ideas to achieve rapid cell growth and large PHB accumulation in C. necator under oxygen-limiting and autotrophic conditions.

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