多部位突然変異体を効率的に構築するための最適化されたinverse PCR戦略

[Optimized inverse PCR strategy for constructing multilocus mutants efficiently].

• Bilin Xu
• Qing Zhu
• Yanyan Chen
• Yongliang Zheng

抄録

タンパク質の変異体は、その構造と機能を研究するための基礎となるものであるが、本研究では、マルチサイト変異体を構築するための効率的かつ迅速な方法を確立することを目的とした。4 つ以上の隣接するアミノ酸残基を変異させる必要がある場合には、まず、2 つの長いプライマーと 2 つの短いプライマー（長いプライマーⅠ/Ⅰ、短いプライマーⅡ/Ⅱ）を設計しました。ロングプライマーは変異部位を含み、変異塩基数は20bp以下、ショートプライマーは変異部位を含まない。次いで、プライマー対（Ⅰ／ⅡおよびⅠ／Ⅱ）とテンプレートを用いて、それぞれ２組の逆ＰＣＲ増幅を行った。増幅後、各系は変異部位を含む非メチル化線形プラスミドを得ることができ、プライマーⅠ／ⅡおよびⅢ／Ⅳで増幅された２組の線形プラスミドのブレークポイントは、変異部位の両側に分布していた。メチル化テンプレートを除去するためにDpnⅠで消化した後、等モル比で混合された回収されたPCR産物を、変性およびアニーリングの別のラウンドを行った。2組の直鎖プラスミドを95℃で変性した後、お互いの一本鎖DNAをテンプレートとしてアニーリングしてオープンループプラスミドを形成し、オープンループプラスミドを大腸菌コンピテント細胞に形質転換した後、突然変異を含む形質転換体を得る。その結果、この方法では、4～11個の連続したアミノ酸残基（8～20bp）を同時に変異させることができ、マルチサイト変異体の構築が大幅に容易になり、タンパク質の構造・機能研究の効率がさらに向上することが示されました。

Mutants of proteins are the basis for studying their structure and function, this work aimed to establish an efficient and rapid method for constructing multi-site mutants. When four or more adjacent amino acid residues need to be mutated, firstly, two long and two short primers (long primers Ⅰ/Ⅰ, short primersⅡ/Ⅱ) were designed: the long primers contain mutated sites, and the number of mutant bases is ≤20 bp, the short primers do not contain mutated sites; GC contents of the long and short primers are ≤80%, and the difference of annealing temperature is ≤40 °C. Then two sets of reverse PCR amplifications were performed using primer pairs (Ⅰ/Ⅱand Ⅰ/Ⅱ) and templates, respectively. After amplification, each system can obtain non-methylated linear plasmids which contain mutated sites, and the breakpoints of the two sets of linear plasmids amplified by primers Ⅰ/Ⅱ and Ⅲ/Ⅳ were distributed on both sides of the mutated sites. Followed by digested by DpnⅠ to remove the methylated templates, the recovered PCR products, which were mixed in an equimolar ratio, were performed another round of denaturation and annealing: the two sets of linear plasmids were denatured at 95 °C and then annealed with each other's single-stranded DNA as templates to form open-loop plasmids, and then the transformants containing the mutations will be obtained after transformed the open-loop plasmids into Escherichia coli competent cells. Results showed that, this method can mutate 4 to 11 consecutive amino acid residues (8-20 bp) simultaneously, which will greatly simplify the construction of multi-site mutants, Thereby improve the efficiency of protein structure and function research further.

蛋白質质的突变体是研究其结构和功能能的基础，．文中旨在建立一种高效、快捷的多位点突变体构建方法。当要突变 4 个及以上相邻的氨基酸残基时，设计两长两短（长引物Ⅰ/Ⅰ、短引物Ⅱ/Ⅱ）。4 条引物：长引物包含突位变点，且突变碱基数≤20 bp，短引物不包含突变位点；两条引物的GC 含量≤80%、退火温度之差≤40 ℃，分别以Ⅰ/Ⅱ和Ⅰ/Ⅱ两对引物和模板进行两组反向PCR 扩增。扩增后各体系均可得到含有突变位点的非甲基化线性质粒，且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅰ/Ⅱ为引物扩增得到的两组线性质粒的断开位点分布在突变位点两侧。用 DpnⅠ酶切回收后等摩尔比混合的PCR 産物除去甲基化模板，再进行一轮变性和退火处理，两组线性质粒在95 ℃变性后互相以来自对方的单链DNA 为模板退火形成开环质粒，转化大肠杆菌感受细胞即可得到包含突变位点的转化子。该方法可同时突变4-11 个连续基酸残基 (8-)20 bp，将大幅简化多位点突变体的构建，从而进一步提高蛋白质结构和功能研究的效率。

蛋白质的突变体是研究其结构和功能的基础，文中旨在建立一种高效、快捷的多位点突变体构建方法。当要突变 4 个及以上相邻的氨基酸残基时，设计两长两短 (长引物Ⅰ/Ⅰ、短引物Ⅱ/Ⅱ) 4 条引物：长引物包含突变位点，且突变碱基数≤20 bp，短引物不包含突变位点；两条引物的GC 含量≤80%、退火温度之差≤40 ℃，分别以Ⅰ/Ⅱ和Ⅰ/Ⅱ两对引物和模板进行两组反向 PCR 扩增。扩增后各体系均可得到含有突变位点的非甲基化线性质粒，且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅰ/Ⅱ为引物扩增得到的两组线性质粒的断开位点分布在突变位点两侧。用 DpnⅠ酶切回收后等摩尔比混合的PCR 产物除去甲基化模板，再进行一轮变性和退火处理，两组线性质粒在95 ℃变性后互相以来自对方的单链DNA 为模板退火形成开环质粒，转化大肠杆菌感受态细胞即可得到包含突变位点的转化子。结果表明，该方法可同时突变4–11 个连续氨基酸残基 (8–20 bp，将大幅简化多位点突变体的构建，从而进一步提高蛋白质结构和功能研究的效率。.