2つの細胞株におけるフラビウイルス産生の比較特性。ヒト肝腫由来のHuh7.5.1-8とアフリカ緑猿腎臓由来のVero

Comparative characterization of flavivirus production in two cell lines: Human hepatoma-derived Huh7.5.1-8 and African green monkey kidney-derived Vero.

• Kyoko Saito
• Masayoshi Fukasawa
• Yoshitaka Shirasago
• Ryosuke Suzuki
• Naoki Osada
• Toshiyuki Yamaji
• Takaji Wakita
• Eiji Konishi
• Kentaro Hanada

抄録

フラビウイルス科は、ポジセンス一本鎖RNAゲノムを持つエンベロープ型ウイルスの一族である。フラビウイルス属の日本脳炎ウイルス（JEV）や黄熱病ウイルス（YFV）、ヘパシウイルス属のC型肝炎ウイルスなど、人間の健康を脅かすウイルスを多く含んでいる。フラビウイルス科のウイルスに対して非常に寛容な細胞培養系は、ウイルスの単離、増殖、診断、生物学的理解、ワクチンや抗ウイルス剤の開発に非常に有用である。以前、我々は、C型肝炎ウイルス感染に対して高い寛容性を有するヒト肝腫HuH-7由来の細胞クローンHuh7.5.1-8を単離した。ここでは，Huh7.5.1-8細胞株におけるフラビウイルス感染の特徴を，幅広いスペクトルのウイルスに寛容なアフリカミドリザル腎臓由来のVero細胞株と比較することで明らかにした．JEV に感染すると、Huh7.5.1-8 細胞は感染初期に多くのウイルス粒子を産生し、Vero 細胞よりもウイルス誘発細胞死に感受性が高かった。同様の結果は、別のフラビウイルスであるYFV（17D-204株）に感染させた場合にも得られた。細胞および細胞外ウイルスRNAの定量化により、Huh7.5.1-8細胞における高いJEV産生は、感染初期の迅速なウイルス複製動態および効率的なウイルス放出に起因することが明らかになった。プラークアッセイでは、Huh7.5.1-8細胞はVero細胞よりも迅速にJEVプラークを形成した。YFVプラークについてはそうではなかったが、Huh7.5.1-8細胞はVero細胞よりも高い数のYFVプラークを発現した。抗ウイルスRNAヘリカーゼRIG-IをコードするcDNAの配列解析を行ったところ、Huh7.5.1-8細胞は、既知のドミナント・ネガティブ・ミスセンス変異を持つ完全長のRIG-I mRNAだけでなく、変異のない変異体も発現していた。しかし、後者のmRNAはエクソン5/6-12を欠いており、細胞内でのRIG-Iの機能損失を示していた。Huh7.5.1-8細胞株のこれらの特徴は、フラビウイルスの検出、滴定、および伝播に有用である。

The Flaviviridae is a family of enveloped viruses with a positive-sense single-stranded RNA genome. It contains many viruses that threaten human health, such as Japanese encephalitis virus (JEV) and yellow fever virus (YFV) of the genus Flavivirus as well as hepatitis C virus of the genus Hepacivirus. Cell culture systems highly permissive for the Flaviviridae viruses are very useful for their isolation, propagation, and diagnosis, an understanding of their biology, and the development of vaccines and antiviral agents. Previously, we isolated a human hepatoma HuH-7-derived cell clone, Huh7.5.1-8, which is highly permissive to hepatitis C virus infection. Here, we have characterized flavivirus infection in the Huh7.5.1-8 cell line by comparing with that in the African green monkey kidney-derived Vero cell line, which is permissive for a wide spectrum of viruses. Upon infection with JEV, Huh7.5.1-8 cells produced a higher amount of virus particles early in infection and were more susceptible to virus-induced cell death than Vero cells. Similar outcomes were obtained when the cells were infected with another flavivirus, YFV (17D-204 strain). Quantification of cellular and extracellular viral RNA revealed that high JEV production in Huh7.5.1-8 cells can be attributed to rapid viral replication kinetics and efficient virus release early in infection. In a plaque assay, Huh7.5.1-8 cells developed JEV plaques more rapidly than Vero cells. Although this was not the case with YFV plaques, Huh7.5.1-8 cells developed higher numbers of YFV plaques than Vero cells. Sequence analysis of cDNA encoding an antiviral RNA helicase, RIG-I, showed that Huh7.5.1-8 cells expressed not only a full-length RIG-I mRNA with a known dominant-negative missense mutation but also variants without the mutation. However, the latter mRNAs lacked exon 5/6-12, indicating functional loss of RIG-I in the cells. These characteristics of the Huh7.5.1-8 cell line are helpful for flavivirus detection, titration, and propagation.