2 段階のフィードバッチ法による工業的に有用な酸化酵素の高レベル生産：アラビノース誘導性大腸菌系における異化抑制の克服

High-level production of industrially relevant oxidases by a two-stage fed-batch approach: overcoming catabolite repression in arabinose-inducible Escherichia coli systems.

• Ramón Román
• Nikola Lončar
• Antoni Casablancas
• Marco W Fraaije
• Glòria Gonzalez

抄録

酵素応用への関心の高まりに伴い、経済的で安価で柔軟性のある酵素生産プロセスが急務となっている。本論文では、5-ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（HMFO）とオイゲノールオキシダーゼ（EUGO）という2つの補酵素含有オキシダーゼを生産するための高細胞密度フェッドバッチプロセスを開発した。このアプローチは、鉱物培地を使用しながら発現を駆動するためのアラビノース誘導系を含むものであった。アラビノース誘導型プロモーターの大きな欠点であるグルコースによる炭素異化分解抑制（CCR）を克服するために、我々は、グルコースを炭素源として、乾燥細胞重量（DCW）が70g/Lを超える細胞密度に到達することを可能にする、高細胞密度培養（HCDC）、2段階のフェッドバッチプロトコルを開発した。その後、炭素源をグリセロールに変更しながら、アラビノースを添加することによって誘導を達成した。この戦略により、アラビノース誘導性株で一般的に使用されているテリフィックブロス（ＴＢ）を用いた二レンマイヤーフラスコ中での参考バッチ発酵と比較して、組換えＨＭＦＯの力価が８倍に増加することを得ることができた。最適化されたプロトコルは、構造的に無関係なオキシダーゼ、EUGOの発現についても試験され、同様の収率が達成された。明らかに、比較的安価な培地（TBと比較した場合）を使用することができるこの2段階のプロトコルは、コストを削減し、IPTGベースのシステムと同様のタンパク質生産レベルを得る方法を提供しています。重要なポイント： - アラビノースプロモーターはCCR効果のため、HCDC生産にはあまり適していない。 この欠点は、2段階のFed-バッチプロトコールを使用することで克服された。

With the growing interest in enzyme applications, there is an urgent demand for economic, affordable, and flexible enzyme production processes. In the present paper, we developed a high cell density fed-batch process for the production of two cofactor-containing oxidase, 5-hydroxymethylfurfural oxidase (HMFO) and eugenol oxidase (EUGO). The approach involved the arabinose-inducible system to drive the expression while using mineral media. In order to overcome a major drawback of arabinose-inducible promoters, carbon catabolite repression, (CCR) by glucose, we developed a high cell density culture (HCDC), two-stage fed-batch protocol allowing us to reach cell densities exceeding 70 g/L of dry cell weight (DCW) using glucose as carbon source. Then, induction was achieved by adding arabinose, while changing the carbon source to glycerol. This strategy allowed us to obtain an eightfold increase in recombinant HMFO titer when compared with a reference batch fermentation in Erlenmeyer flasks using terrific broth (TB), typically used with arabinose-inducible strains. The optimized protocol was also tested for expression of a structurally unrelated oxidase, EUGO, where a similar yield was achieved. Clearly, this two-step protocol in which a relatively cheap medium (when compared to TB) can be used reduces costs and provides a way to obtain protein production levels similar to those of IPTG-based systems. KEY POINTS: • Arabinose promoters are not well suited for HCDC production due to CCR effect. • This drawback has been overcome by using a two-stage Fed-batch protocol. • Protein yield has been increased by an eightfold factor, improving process economics.