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ヒト単球由来樹状細胞の迅速な単球単離と生成のためのプロトコル
A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.
PMID: 32271804 PMCID: PMC7145147. DOI: 10.1371/journal.pone.0231132.
抄録
単球由来樹状細胞（moDCs）は、末梢血単核球（PBMC）から単核球を直接分離した後の簡便な方法として、免疫学的研究に広く利用されている樹状細胞のサブセットです。単球の精製および細胞培養の両方が、単球のmoDCsへの分化に影響を与える。単球を単離してmoDCsに分化させる方法はまだ議論の余地がある。我々は、PBMCから単球を分離するための3つの異なるプロトコルを比較することを目的とした：1）コールドアグリゲーション、2）パーコール勾配、および3）磁気ビーズ細胞濃縮。さらに、我々はまた、4つの異なる単球の分化と培養技術を比較しました。1) 細胞培地、2) 血清源、3) 必要とされる GM-CSF と IL-4 の濃度、4) 細胞培養系。分離／分化の程度を決定するために、光散乱および／またはＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ２０９などのパン表面マーカーの発現のフローサイトメトリー分析を使用した。精製されたPBMCを2段階のコールドアグリゲーションを行ったところ、95％程度の細胞生存率が得られたが、単球の濃縮度は低かった（単球の増加とリンパ球の減少は統計的に有意ではなかった、p>0.05）。逆に、PBMCから単球を分離し、不連続的なPercoll勾配を与えた場合には、約50％の細胞生存率が得られた。しかし、リンパ球汚染物質の有意な減少（p≤0.05）が観察された。磁気ビーズを用いた細胞濃縮法は、他の全ての手法と比較して、95%以上の細胞生存率が得られ、有意なリンパ球減少(p≤0.005)が見られた。また、GM-CSFとIL-4を500IU/mL添加したRPMI培地で半従属的に培養した場合、moDCsはCD209の発現量は増加したが、CD14の発現量は減少した。血清源は培養性能に影響を及ぼさなかった。結論として、磁気ビーズ細胞濃縮法は優れた細胞生存率を示し、このアプローチは単球を単離するのに適しており、その後、適切な培地、血清、サイトカイン、培養系で培養したmoDCは単球のmoDCへの分化に影響を与える可能性があることが示された。
The monocyte-derived dendritic cells (moDCs) are a subset of dendritic cells widely used in immunological studies as a convenient and easy approach after isolation of mononuclear cells directly from peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Both the purification and cell culture of monocytes impact on the differentiation of monocytes into moDCs. The methodology to isolate and differentiate monocytes into moDCs is still controversial. We aimed to compare three different protocols for monocyte isolation from PBMC: 1) Cold-aggregation; 2) Percoll gradient; and 3) Magnetic beads cell-enrichment. Additionally we also compared four different monocyte differentiation and culture techniques: 1) Cell culture media; 2) Serum sources; 3) required GM-CSF and IL-4 concentrations; 4) Cell culture systems. We used flow cytometry analysis of light scattering and/or expression of pan surface markers, such as CD3, CD14 and CD209 to determine isolation/differentiation degree. Purified PBMC followed by two steps of cold aggregation, yielded cell viability around 95% with poor monocyte enrichment (monocytes increase vs. lymphocytes reduction was not statistically significant, p>0.05). Conversely, monocyte isolation from PBMC with discontinuous Percoll gradient generated around 50% cell viability. Albeit, we observed a significant reduction (p≤0.05) of lymphocytes contaminants. The magnetic beads cell-enrichment yield cell viability higher than 95%, as high as a significant lymphocyte depletion (p≤0.005) when compared to all other techniques employed. The moDCs showed better differentiation based on increased CD209 expression, but lower CD14 levels, when cells were cultured in RPMI medium plus 500IU/mL of both GM-CSF and IL-4 in a semi-adherent fashion. Serum sources showed no influence on the culture performance. In conclusion, the magnetic beads cell-enrichment showed superior cell viability, indicating that this approach is a better choice to isolate monocytes, and moDCs cultured afterwards in appropriate medium, serum, cytokines and culture system might influence the monocytes differentiation into moDC.