高活性合成サイトカイン受容体リガンドの効率的な生産と精製のための多量化戦略

Multimerization strategies for efficient production and purification of highly active synthetic cytokine receptor ligands.

• Sofie Mossner
• Hoang T Phan
• Saskia Triller
• Jens M Moll
• Udo Conrad
• Jürgen Scheller

抄録

サイトカインのシグナル伝達は細胞表面の受容体によって行われており、この受容体は免疫反応などの細胞機能を制御する天然の生体スイッチとして機能しています。近年、我々は緑色蛍光タンパク質（GFP）とmCherryナノボディをサイトカイン受容体の膜貫通ドメインと細胞内ドメインに融合させた合成サイトカイン受容体（SyCyRs）を設計した。ホモおよびヘテロ二量体のGFP-mCherry融合タンパク質で刺激すると、得られた受容体は、生理的に発生するサイトカインによって誘導されるシグナルを表現することができた。大腸菌やCHO-K1細胞でGFPとmCherry融合タンパク質を作製したが、全体的な収率と安定性は低かった。そこで、我々は2つの代替的な多量化戦略を適用し、免疫グロブリンFcを介在する二量体およびコイル状コイル状GCN4pIIを介在する三量体集合体を達成した。GFP-および／またはmCherry-Fcホモ二量体は、インターロイキン6ファミリーのサイトカインに自然に応答する合成gp130サイトカイン受容体を活性化した。これらの合成gp130受容体の活性化は、STAT3およびERKリン酸化をもたらし、Ba/F3-gp130細胞のその後の増殖をもたらした。二量体GFP-FcおよびmCherry-Fcについて、それぞれ8.1 ng/mlおよび0.64 ng/mlの半最大有効濃度（EC50）が決定された。これは、ネイティブサイトカインの予想されるEC50の範囲内であった。さらに、4量体および6量体のGFP-mCherry-Fc融合タンパク質を作製したが、これもまた生物学的に活性であった。このことは、効率的な受容体活性化のためには、2つのサイトカイン受容体の緊密な並置が重要であることを強調した。最後に、3量体のGCN4pIIモチーフを用いて、ホモ3量体GFPとmCherry複合体を生成した。これらの合成サイトカインは、二量体のFc融合型サイトカインと比較して、EC50値（GFP3：0.58 ng/ml、mCherrry3：0.37 ng/ml）が改善された。結論として、合成サイトカイン受容体の活性化に有効で安定な多量体合成サイトカイン受容体リガンドの作製に成功した。

Cytokine signaling is transmitted by cell surface receptors which act as natural biological switches to control cellular functions such as immune reactions. Recently, we have designed synthetic cytokine receptors (SyCyRs) consisting of green fluorescent protein (GFP)- and mCherry-nanobodies fused to the transmembrane and intracellular domains of cytokine receptors. Following stimulation with homo- and heterodimeric GFP-mCherry fusion proteins, the resulting receptors phenocopied signaling induced by physiologically occurring cytokines. GFP and mCherry fusion proteins were produced in E. coli or CHO-K1 cells, but the overall yield and stability was low. Therefore, we applied two alternative multimerization strategies and achieved immunoglobulin Fc-mediated dimeric and coiled-coil GCN4pII-mediated trimeric assemblies. GFP- and/or mCherry-Fc homodimers activated synthetic gp130 cytokine receptors, which naturally respond to Interleukin 6 family cytokines. Activation of these synthetic gp130 receptors resulted in STAT3 and ERK phosphorylation and subsequent proliferation of Ba/F3-gp130 cells. Half-maximal effective concentrations (EC50) of 8.1 ng/ml and 0.64 ng/ml were determined for dimeric GFP-Fc and mCherry-Fc, respectively. This is well within the expected EC50 range of the native cytokines. Moreover, we generated tetrameric and hexameric GFP-mCherry-Fc fusion proteins, which were also biologically active. This highlighted the importance of close juxtaposition of two cytokine receptors for efficient receptor activation. Finally, we used a trimeric GCN4pII motif to generate homo-trimeric GFP and mCherry complexes. These synthetic cytokines showed improved EC50 values (GFP3: 0.58 ng/ml; mCherrry3: 0.37 ng/ml), over dimeric Fc fused variants. In conclusion, we successfully generated highly effective and stable multimeric synthetic cytokine receptor ligands for activation of synthetic cytokine receptors.