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ホルスタイン牛の妊娠中および黄体融解期の泌乳牛黄体部における安定遺伝子の同定。逆転写定量 PCR 基準遺伝子の選択への示唆
Identification of stable genes in the corpus luteum of lactating Holstein cows in pregnancy and luteolysis: Implications for selection of reverse-transcription quantitative PCR reference genes.
PMID: 32229123 DOI: 10.3168/jds.2019-17526.
抄録
泌乳中の乳牛の黄体は、妊娠維持、受胎可能性、周期性に不可欠なダイナミックな内分泌組織である。したがって、黄体生理の基礎となるプロセスを理解することは、牛の繁殖効率を向上させるために必要である。黄体生理を調べるための一般的な手法は、遺伝子発現を定量するための貴重なツールである逆転写定量PCR（RT-qPCR）である。しかし、参照遺伝子を用いた RT-qPCR 定量化法では、mRNA 発現を正確に評価するためには、安定に発現している遺伝子を利用する必要がある。歴史的に、牛における参照遺伝子の選択は、小さなプールの参照遺伝子の主観的な選択に依存しており、その多くは異なる組織や生理状態間での発現変動が大きい可能性がある。これは、黄体分解中に急速な生理的変化を起こす能力を持つ CL のようなダイナミックな組織や、妊娠中に CL を維持するというあまり特徴のない時期には特に問題となります。したがって、ウシのCLに適した参照遺伝子を同定する必要があります。全トランスクリプトーム RNA シーケンシングは、mRNA トランスクリプトームの全プールの発現プロファイルを評価することができるため、新しい参照遺伝子を同定するための有効な方法である。本研究では、妊娠初期から黄体分解までのウシのCLにおいて、13の新規参照遺伝子をRNAシークエンシングにより同定した。RPL4、UQCRFS1、COX4I1、RPS4X、SSR3、CST3、ZNF266、CDC42、CD63、HIF1A、YWHAE、EIF3E、PPIB。妊娠および回帰からのCL組織の別のセットにおける発現安定性を確認するために、3つのサンプルのグループについて解析を行い、独立したRT-qPCR解析を行った。(1)全サンプル、(2)妊娠中のみのサンプル、(3)CL回帰の過程を通してのサンプルの3つのグループについて解析を行った。7つの遺伝子は、従来の2つの基準遺伝子（ACTBとGAPDH）よりも、すべての状態で安定であることがわかった。RPS4X、COX4I1、PPIB、SSR3、RPL4、YWHAE、およびCDC42である。また、妊娠動物からのCL組織を単独で解析したところ、CST3、HIF1A、CD63もACTBやGAPDHよりも安定であることが確認された。これらの新しい参照遺伝子を同定することで、RT-qPCR 結果の正確な正規化が可能となり、黄体生理に関連する遺伝子発現の適切な解釈に貢献することが期待されます。さらに、今回の解析により、ウシ CL における遺伝子発現の安定性に及ぼす黄体分解や妊娠の影響についても明らかになりました。
In lactating dairy cattle, the corpus luteum (CL) is a dynamic endocrine tissue vital for pregnancy maintenance, fertility, and cyclicity. Understanding processes underlying luteal physiology is therefore necessary to increase reproductive efficiency in cattle. A common technique for investigating luteal physiology is reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR), a valuable tool for quantifying gene expression. However, reference-gene-based RT-qPCR quantification methods require utilization of stably expressed genes to accurately assess mRNA expression. Historically, selection of reference genes in cattle has relied on subjective selection of a small pool of reference genes, many of which may have significant expression variation among different tissues or physiologic states. This is particularly concerning in dynamic tissues such as the CL, with its capacity for rapid physiologic changes during luteolysis, and likely in the less characterized period of CL maintenance during pregnancy. Thus, there is a clear need to identify reference genes well suited for the bovine CL over a wide range of physiological states. Whole-transcriptome RNA sequencing stands as an effective method to identify new reference genes by enabling the assessment of the expression profile of the entire pool of mRNA transcripts. We report the identification of 13 novel putative reference genes using RNA sequencing in the bovine CL throughout early pregnancy and luteolysis: RPL4, UQCRFS1, COX4I1, RPS4X, SSR3, CST3, ZNF266, CDC42, CD63, HIF1A, YWHAE, EIF3E, and PPIB. Independent RT-qPCR analyses were conducted confirming expression stability in another set of CL tissues from pregnancy and regression, with analyses performed for 3 groups of samples: (1) all samples, (2) samples from pregnancy alone, and (3) samples throughout the process of CL regression. Seven genes were found to be more stable in all states than 2 traditional reference genes (ACTB and GAPDH): RPS4X, COX4I1, PPIB, SSR3, RPL4, YWHAE, and CDC42. When CL tissues from pregnant animals alone were analyzed, CST3, HIF1A, and CD63 were also identified as more stable than ACTB and GAPDH. Identification of these new reference genes will aid in accurate normalization of RT-qPCR results, contributing to proper interpretation of gene expression relevant to luteal physiology. Furthermore, our analysis sheds light on the effects of luteolysis and pregnancy on the stability of gene expression in the bovine CL.
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