蛋白質を用いて、遺伝子組換えとKRAS/RAF-RBDの相互作用を同時にモニタリングするデュアルパラメトリックアッセイの開発を行っています

Homogeneous Dual-Parametric-Coupled Assay for Simultaneous Nucleotide Exchange and KRAS/RAF-RBD Interaction Monitoring.

• Kari Kopra
• Emmiliisa Vuorinen
• Maria Abreu-Blanco
• Qi Wang
• Ville Eskonen
• William Gillette
• Arto T Pulliainen
• Matthew Holderfield
• Harri Härmä

抄録

我々は、連結RASヌクレオチド交換およびRAS/RAF-RBD相互作用アッセイに導入された迅速かつ高感度なシングルウェルデュアルパラメトリック法を開発した。RAS突然変異は、複数の異なるヒト癌の頻発因子であるが、治療戦略の開発は困難を極めている。従来、RASの機能を破壊するための取り組みは、ヌクレオチド交換阻害剤、GTP-RAS相互作用阻害剤、変異RASタンパク質のGTPase活性を高める活性化剤に焦点が当てられてきた。生物学的知識の量が増えるにつれ、ハイスループットなスクリーニングを可能にする標的生化学的アッセイがますます興味深いものになってきています。これまでに、RASやヘテロ三量体Gタンパク質を用いたヌクレオチド結合研究のためのホモジニアス・クエンチング共鳴エネルギー移動（QRET）アッセイを紹介してきましたが、今回、新たにホモジニアス・クエンチング共鳴エネルギー移動（QRET）アッセイを導入し、RASやヘテロ三量体Gタンパク質を用いたヌクレオチド結合研究を開始しました。ここでは、QRET技術と時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動（TR-FRET）を組み合わせたQTR-FRETと呼ばれる新しいホモジニアスシグナル伝達法を紹介します。デュアルパラメトリックQTR-FRET技術は、グアニンヌクレオチド交換因子によって誘導されたRASへのEu-GTP結合を615 nmでモニターし、その後のEu-GTP負荷RASとRAF-RBD-Alexa680との相互作用を730 nmでモニターすることを可能にします。両方の反応は、インヒビタースクリーニングおよびリアルタイム反応モニタリングに適用可能なシングルウェルアッセイでモニターした。この均質なアッセイにより、低ナノモル濃度のタンパク質を用いて、ヌクレオチド交換阻害剤とRAS/RAF相互作用阻害剤の両方を分離して検出することが可能となりました。さらに、G(i)αのGTP負荷および百日咳毒素触媒によるG(i)αのADPリボシル化にも適用し、新規なγ-GTP-Eu分子を合成した。本研究では、ここで紹介したQTR-FRET検出法が、様々なターゲットに対するデュアルパラメトリックアッセイに容易に適用できることを示している。

We have developed a rapid and sensitive single-well dual-parametric method introduced in linked RAS nucleotide exchange and RAS/RAF-RBD interaction assays. RAS mutations are frequent drivers of multiple different human cancers, but the development of therapeutic strategies has been challenging. Traditionally, efforts to disrupt the RAS function have focused on nucleotide exchange inhibitors, GTP-RAS interaction inhibitors, and activators increasing GTPase activity of mutant RAS proteins. As the amount of biological knowledge grows, targeted biochemical assays enabling high-throughput screening have become increasingly interesting. We have previously introduced a homogeneous quenching resonance energy transfer (QRET) assay for nucleotide binding studies with RAS and heterotrimeric G proteins. Here, we introduce a novel homogeneous signaling technique called QTR-FRET, which combine QRET technology and time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET). The dual-parametric QTR-FRET technique enables the linking of guanine nucleotide exchange factor-induced Eu-GTP association to RAS, monitored at 615 nm, and subsequent Eu-GTP-loaded RAS interaction with RAF-RBD-Alexa680 monitored at 730 nm. Both reactions were monitored in a single-well assay applicable for inhibitor screening and real-time reaction monitoring. This homogeneous assay enables separable detection of both nucleotide exchange and RAS/RAF interaction inhibitors using low nanomolar protein concentrations. To demonstrate a wider applicability as a screening and real-time reaction monitoring method, the QTR-FRET technique was also applied for G(i)α GTP-loading and pertussis toxin-catalyzed ADP-ribosylation of G(i)α, for which we synthesized a novel γ-GTP-Eu molecule. The study indicates that the QTR-FRET detection technique presented here can be readily applied to dual-parametric assays for various targets.