単純ヘルペスウイルス1型に対するオリーブ葉エキスおよびプロポリスとアシクロビルの抗ウイルス効果の比較

[Comparison of Antiviral Effect of Olive Leaf Extract and Propolis with Acyclovir on Herpes Simplex Virus Type 1].

• Mustafa Altındiş
• Ferhat Gürkan Aslan
• Hüseyin Uzuner
• Havva Ünal
• Mehmet Köroğlu
• Sedat Kulaç
• Aynur Karadenizli

抄録

単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）には、ヌクレオシド類似体であるアシクロビルが広く使用されているが、このクラスの薬の頻繁な使用による薬剤耐性ウイルスの出現とその毒性副作用により、新規の活性分子の探索が必要とされている。医学や薬理学の分野では、合成分子の開発が研究されていますが、天然の生理活性化合物の供給源であるハーブは、依然として人気があります。本研究では、オリーブ葉抽出物（OLE）とプロポリスを単独またはアサイクロビルと併用して、HSV-1に対する抗ウイルス効果を検討した。エンドポイント法を用いて、培養細胞の半分に感染したウイルス量（TCID50）を算出し、Spearman-Karber法を用いてウイルス量を測定した。HSV-1に対するOLEとプロポリスの抗ウイルス効果を、従来の細胞培養法とリアルタイム細胞解析法（RTCA）で検討した。2つの抽出物の相互作用およびアシクロビルとの組み合わせはRTCAによって評価された。logTCID50:11.5のHSV-1が入ったチューブに、無毒性濃度の高いものから順に、3種類の希釈液で調製した活性物質を添加し、室温で2つの異なる持続時間（1時間および3時間）放置した。チューブから採取したアリコートをHep-2細胞を含むプレートで培養し、72時間後に評価した。ＨＳＶ-１に対する抗ウイルス効果を示す最低濃度の少なくとも４倍の濃度の抽出物とアシクロビルの組み合わせを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置のｅ-プレート中でＨｅｐ-２細胞と一緒に培養し、３０分間隔で測定値を得、データをリアルタイムで記録した。2種類の持続時間と濃度の異なるOLEとプロポリスを用いた試験では，プロポリスは10μg/ml，OLEは1.2mg/mlの濃度でRTCAを用いて1時間および3時間培養した場合の両方で抗ウイルス効果が認められた．ウイルス量の最大の減少の時間と濃度は、プロポリスでは最初の1時間と10μg/ml、OLEでは最初の1時間と1.2mg/mlであった。また、プロポリスとOLEとアシクロビルを併用しても細胞毒作用は認められず、抽出物を併用しても細胞毒作用の遅延が認められた。これらの結果によれば、プロポリスおよびOLEは、単独でもアシクロビルとの併用でも、HSV-1に対する抗ウイルス効果を有することがわかった。これらの薬剤は、アシクロビルとは異なるメカニズムで作用するため、アシクロビルとの併用投与の場合、アシクロビルの投与量や副作用が軽減される可能性があります。活性型への変換を必要としないこれらの抽出物は、口腔内病変における感染性を低下させ、拡散を防止し、特に免疫不全患者におけるアシクロビル耐性HSV感染症の局所治療に使用される可能性がある。しかし，薬効および潜在的な毒性を決定するためには，in vivo試験を実施する必要がある。これらの結果は、さらなる包括的な研究によって裏付けられ、他のウイルスに対する有効性についても調査されるべきである。

While acyclovir, a nucleoside analogue, is widely used for herpes simplex virus type 1 (HSV-1), emergence of drug-resistant viruses due to frequent usage of this class of medicines, and their toxic side effects require exploring novel active molecules. Despite the studies on developing synthetic molecules in medical sciences and pharmacology, herbs as a natural source of biologically-active compounds remain popular. In this in vitro study, olive leaf extract (OLE) and propolis alone or in combination with acyclovir were investigated for their antiviral efficacy in HSV-1.Toxic doses of OLE, propolis, and dimethyl sulfoxide, propolis diluent, for Hep-2 (ATCC, CCL-23) cells were determined by conventional cell culture. Using "endpoint" method, the viral dose infecting half of the cell culture (TCID50) was calculated, and viral quantity was determined with Spearman-Karber method. Antiviral effects of OLE and propolis on HSV-1 were investigated by conventional cell culture and real-time cell analysis (RTCA). Combinations of the two extracts with one another and with acyclovir were evaluated by RTCA. Active substances prepared at three different dilutions were added to tubes with HSV-1 of logTCID50: 11.5 in descending order starting from the highest non-toxic concentration, and they were left at room temperature for two different durations (one hour and three hours). The aliquots taken from the tubes were cultured in plates containing Hep-2 cells and evaluated after 72 hours. Combinations of extracts and acyclovir at concentrations at least four times lower than the lowest concentration showing antiviral efficacy against HSV-1 were cultured with Hep-2 cells in the e-plates of the xCELLigence RTCA device, measurements were obtained at 30 minute intervals, and data were recorded in real time. In the test with two different durations and at different concentrations of OLE and propolis, antiviral efficacy was observed both with one-hour and three-hour incubation at a concentration of 10 μg/ ml for propolis and 1.2 mg/ml for OLE with RTCA. The duration and concentration of the greatest decrease in viral quantity were in the first one hour and 10 μg/ml for propolis, and in the first one hour and 1.2 mg/ ml for OLE. Combination of propolis and OLE with acyclovir caused no cytopathic effects, and the combination of extracts led to delayed cytopathic effect. According to these results, propolis and OLE, alone and in combinations with acyclovir, have antiviral efficacy against HSV-1. These agents may reduce the dose and side effects of acyclovir in case of co-administration since they exert their effects through a different mechanism than acyclovir,possibly through direct virucidal activity, inhibition of virus internalization or viral inhibition in early stages of replication (inhibition of adsorption/binding of viral particles to the cell). These extracts that do not require conversion to active form have the potential to reduce infectivity in oral lesions, prevent spread, and be used in the topical treatment of acyclovir-resistant HSV infections, particularly in immunocompromised patients. However, in vivo studies should be conducted to determine their medicinal properties and potential toxicities. These results should be supported by further comprehensive studies and the efficacy against other viruses should also be investigated.