RNAの細胞特異的代謝標識のための最適化された化学遺伝学的手法の開発

An optimized chemical-genetic method for cell-specific metabolic labeling of RNA.

• Sarah Nainar
• Bonnie J Cuthbert
• Nathan M Lim
• Whitney E England
• Ke Ke
• Kanika Sophal
• Robert Quechol
• David L Mobley
• Celia W Goulding
• Robert C Spitale

抄録

組織や臓器は多様な細胞型で構成されているため、遺伝子発現の細胞型特異的プロファイリングは大きな課題となっている。現在の代謝標識法は、外因性酵素を発現する細胞でのみRNAに組み込まれる外因性ピリミジンアナログに依存している。このアプローチでは、オフターゲット細胞はこれらのアナログを組み込むことができないと仮定している。我々はこの仮定を反証し、高バックグラウンド取り込みの原因となる酵素経路を同定し、特徴づける。哺乳類細胞がウラシルアナログを取り込むことができることを実証し、高バックグラウンド取り込みの原因となる酵素経路を特徴づける。これらの制限を克服するために、我々はウリジン/シチジンキナーゼ2と2'-アジドウリジンからなる新しい低分子酵素ペアを開発した。ウリジン/シチジンキナーゼ2を発現する細胞にのみ2'-アジドウリジンが取り込まれることを示し、分子動力学とX線結晶構造解析を用いて選択性のメカニズムを明らかにした。さらに、このペアは、特定の細胞集団からのRNAの精製と追跡に使用することができ、高分解能の細胞特異的RNA標識に理想的である。これらの結果は、哺乳類のサルベージ経路の新たな側面を明らかにし、生体分子の細胞特異的標識法の設計、特徴付け、評価のための新たなベンチマークとなる。

Tissues and organs are composed of diverse cell types, which poses a major challenge for cell-type-specific profiling of gene expression. Current metabolic labeling methods rely on exogenous pyrimidine analogs that are only incorporated into RNA in cells expressing an exogenous enzyme. This approach assumes that off-target cells cannot incorporate these analogs. We disprove this assumption and identify and characterize the enzymatic pathways responsible for high background incorporation. We demonstrate that mammalian cells can incorporate uracil analogs and characterize the enzymatic pathways responsible for high background incorporation. To overcome these limitations, we developed a new small molecule-enzyme pair consisting of uridine/cytidine kinase 2 and 2'-azidouridine. We demonstrate that 2'-azidouridine is only incorporated in cells expressing uridine/cytidine kinase 2 and characterize selectivity mechanisms using molecular dynamics and X-ray crystallography. Furthermore, this pair can be used to purify and track RNA from specific cellular populations, making it ideal for high-resolution cell-specific RNA labeling. Overall, these results reveal new aspects of mammalian salvage pathways and serve as a new benchmark for designing, characterizing and evaluating methodologies for cell-specific labeling of biomolecules.