メトホルミンは、PP2A活性化を介してNF-κBを阻害することにより、高グルコース負荷ヒト腎上皮細胞におけるパーキンタンパク発現とマイトファジーを救済します

Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation.

• Yulan Zhao
• Mingjin Sun

抄録

我々の予備研究では、古典的な抗糖尿病薬であるメトホルミンが、in vitroで高グルコース負荷を受けたヒト腎上皮細胞において、パーキンタンパク質の発現とマイトファジーをレスキューできることが明らかになったが、その分子メカニズムはまだ解明されていない。本研究では、ヒト腎皮質上皮細胞（HRCEpiC）およびヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEpic）を、メトホルミン前処理の有無にかかわらず、高グルコース負荷し、パーキンのmRNAおよびタンパク質発現レベルの変化をモニターした。PRKN遺伝子のノックダウンは、レンチウイルスベースのshRNA送達により実施した。細胞生存率、アポトーシスおよびマイトファジーを治療後にモニターした。ミトコンドリアの損傷は、ミトコンドリアの透過性遷移孔の開口、膜電位の変化、ミトコンドリアのスーパーオキサイド蓄積およびチトクロムCの放出を分析することによって評価した。全細胞溶解液中の活性化転写因子４（ＡＴＦ４）、ｐ５３ホスホ-Ｓｅｒ１５、ＩκＢαホスホ-Ｓｅｒ３２、ＩＫＫαホスホ-Ｓｅｒ１７６／１８０の蛋白質レベルとｐ５０／ｐ６５の核内進入をウエスタンブロットで評価した。プロテインホスファターゼ2A（PP2A）を阻害するためにオカダイン酸を使用した。データから、高グルコースチャレンジはPRKN遺伝子発現、マイトファジー、ミトコンドリアの完全性および細胞生存率をin vitroで有意に低下させ、メトホルミンの共処理によって救済されたことが示唆された。メトホルミンの効果は、PRKN遺伝子のノックダウンによって損なわれた。メトホルミンはPRKN遺伝子の転写を増加させ、一方で核内因子κB（NF-κB）の活性化を減少させたが、p53やATF4の活性化は減少しなかった。また、PP2Aを阻害することにより、高グルコース負荷細胞ではメトホルミンのNF-κB阻害作用とPRKN誘導作用が弱まり、ミトコンドリア保護作用と細胞保護作用が低下した。以上のことから、メトホルミンは、PP2A 活性化と NF-κB 阻害を介してパーキン蛋白質の発現とマイトファジーを回復させ、高グルコース誘発性アポトーシスからヒト腎上皮細胞を保護すると結論した。

Our preliminary research revealed that metformin, a classic anti-diabetic drug, could rescue Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells in vitro, but the molecular mechanism remains to be explored. In the study, Human Renal Cortical Epithelial Cells (HRCEpiC) and Human Renal Proximal Tubular Epithelial Cells (HRPTEpic) were challenged with high glucose with or without metformin pre-treatment to monitor Parkin mRNA and protein expression level change. PRKN gene knockdown was performed by lentiviral-based shRNA delivery. Cell viability, apoptosis and mitophagy were monitored after treatment. Mitochondrial damage was evaluated by analyzing mitochondrial permeability transition pore opening, membrane potential change, mitochondrial superoxide accumulation and cytochrome C release. Protein levels of activating transcription factor 4 (ATF4), p53 phospho-Ser15, IκBα phosphor-Ser32, IKKα phosphor-Ser176/180 in whole cell lysate and nuclear entry of p50/p65 were assessed by western blot. Okadaic acid was used to inhibit protein phosphatase 2A (PP2A). The data suggested high glucose challenge significantly reduced PRKN gene expression, mitophagy, mitochondria integrity and cell viability in vitro, which was rescued by metformin co-treatment. The effects of metformin were crippled by PRKN gene knockdown. Metformin increased PRKN gene transcription while reducednuclear factor kappa B (NF-κB) activation but not that of p53 or ATF4. Inhibiting PP2A weakened NF-κB inhibition and PRKN induction by metformin in high glucose-challenged cells, reducing its mitochondrial protective and cytoprotective effect. So, we concluded thatmetformin protects human renal epithelial cells from high glucose-induced apoptosis by restoring Parkin protein expression and mitophagy via PP2A activation and NF-κB inhibition.

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