ヒト精子中の活性酸素の検出のための蛍光プローブ

Fluorescent probes for the detection of reactive oxygen species in human spermatozoa.

• Sara Escada-Rebelo
• Francisca G Mora
• Ana P Sousa
• Teresa Almeida-Santos
• Artur Paiva
• João Ramalho-Santos

抄録

活性酸素（ROS）産生は、ミトコンドリア活動の副産物であり、機能的な精子の条件であるキャパシティ状態を獲得するために必要である。しかし、活性酸素の異常産生による酸化ストレスの増加は、精子の機能低下と関連していることが示されており、この細胞の特異的な性質を考えると、精子の活性酸素を正確に検出することの重要性が強調されている。本研究では、ヒト精子中の活性酸素と反応性窒素種（RNS）を検出するために、市販されている様々な蛍光プローブを試験し、その特異性を明らかにした。フローサイトメトリー（FC）と蛍光顕微鏡（FM）の両方を用いて、MitoSOX™ Red とジヒドロエチジウム（DHE）はスーパーオキシドアニオン（アンチマイシン A をポジティブコントロールとして使用して決定）を検出し、DAF-2A は反応性窒素種（すなわち、一酸化窒素）を検出することを確認しました。また、RedoxSensor™ Red CC-1、CellROX Orange Reagent、およびMitoPY1は、過酸化水素にはほとんど感度があるようですが、スーパーオキサイドには感度がないことも初めて報告します。さらに、平均蛍光強度（標識細胞の割合ではなく）は、この種の方法論を用いて再現性のあるモニタリングが可能な主なパラメータである。

Reactive oxygen species (ROS) production is a by-product of mitochondrial activity and is necessary for the acquisition of the capacitated state, a requirement for functional spermatozoa. However, an increase in oxidative stress, due to an abnormal production of ROS, has been shown to be related to loss of sperm function, highlighting the importance of an accurate detection of sperm ROS, given the specific nature of this cell. In this work, we tested a variety of commercially available fluorescent probes to detect ROS and reactive nitrogen species (RNS) in human sperm, to define their specificity. Using both flow cytometry (FC) and fluorescence microscopy (FM), we confirmed that MitoSOX™ Red and dihydroethidium (DHE) detect superoxide anion (as determined using antimycin A as a positive control), while DAF-2A detects reactive nitrogen species (namely, nitric oxide). For the first time, we also report that RedoxSensor™ Red CC-1, CellROX Orange Reagent, and MitoPY1 seem to be mostly sensitive to hydrogen peroxide, but not superoxide. Furthermore, mean fluorescence intensity (and not percentage of labeled cells) is the main parameter that can be reproducibly monitored using this type of methodology.