膠原病性関節炎ラットにおける耐容性樹状細胞調製技術の最適化

[Optimization of tolerogenic dendritic cell preparation technique in rats with collagen-induced arthritis].

• Yan Tan
• Yaling Tian
• Lichang Ning
• Hongmei Jiang

抄録

目的 改造コラーゲン誘導性関節炎（CIA）ラットの脾臓から TolDC を調製する技術を改良し、治療介入のための高品質な耐容性樹状細胞（TolDC）を得ることを目的とした。方法 単核細胞の分離過程において、単細胞懸濁液の調製、単核細胞のプレート播種後の培養時間の調整などの改良を行った。TolDCs は、細胞培養開始時に NF-κB オリゴヌクレオチド（ODN）デコイ ドを投与することにより誘導した。細胞の形態を顕微鏡で観察し、細胞の生存率をトリパンブルー染色で明らかにした。また、フローサイトメトリーを用いて、CD103（OX62）、CD80、CD86 の発現を測定し、DC 刺激リンパ球の増殖を混合リンパ球反応（MLR）後の MTT アッセイで測定した。結果 確立されたアプローチにより、得られた細胞の生存率は90％以上に達し、OX62陽性細胞の割合は87.4％以上であり、理想的なDC表現型であることが確認された。機能的には、NF-κB ODN 処理した DC の忍容性は、コスチマイモ ル（CD80 および CD86）の発現が低く、リンパ球刺激効果の発現能力が低下していることからも明らかとなった。結論 最適化された脾臓単核球調製法により単離された CIA ラット脾臓由来 TolDC は、従来法で作製された TolDC と比較して、より高い制御活性、より高い表現型安定性、より高い純度、より高い忍容性を示した。

Objective To yield high-quality tolerogenic dendritic cells (TolDCs) for therapeutic intervention by a refined technique of TolDC preparation from the spleen of modified collagen-induced arthritis (CIA) rats. Methods The refinements took place amid monocellular cell isolation process, including both the preparation of single cell suspension and the adjustment of incubation time after plate seeding of mononuclear cells. TolDCs were induced by administration of NF-κB oligonucleotide (ODN) decoy at the initiation of cell culture. Cell morphology was examined under a microscope and cell viability was revealed by trypan blue staining. Expression of classical cell identity and activation makers, CD103 (OX62), CD80 and CD86 was determined by flow cytometry; meanwhile, DC-stimulated lymphocyte proliferation was measured by MTT assay following mixed lymphocyte reaction (MLR). Results With the established approach, the viability ratio of resulting cells reached over 90% and the proportion of OX62 positive ones was above 87.4%, which altogether confirmed their ideal DC phenotype. Functionally, the tolerogenic nature of the NF-κB ODN-treated DCs was further unveiled by the low expression of costimulatory molecules (CD80 and CD86) and the abrogated capacity of lymphocyte stimulation effect. Conclusion Compared with TolDCs generated by conventional protocol, CIA rat spleen-derived TolDCs isolated by the optimized splenic mononuclear cell preparation procedure and induced by NF-κB ODN decoy show the higher regulatory activity, higher phenotypic stability, higher purity and tolerogenic properties.