DHIVをKIVに変換する酵素の開発を試みる

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Protein Eng. Des. Sel..2019 12;32(6):261-270. 5685776. doi: 10.1093/protein/gzz042.

DHIVをKIVに変換する酵素の開発を試みる

Attempts to develop an enzyme converting DHIV to KIV.

Kenji Oki
Frederick S Lee
Stephen L Mayo

PMID: 31872250 DOI: 10.1093/protein/gzz042.

抄録

ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（DHAD）は、酸化に敏感で合成に高価なFe-Sクラスターを補酵素として使用して、R-2,3-ジヒドロキシイソバレレート（DHIV）の2-ケトイソバレレート（KIV）への脱水を触媒します。これに対し、糖酸脱水酵素はマグネシウムイオンを触媒として同じ化学反応を行います。ここで私たちは、高コストなDHADを、計算機的タンパク質設計（CPD）を用いて、コスト効率の高い糖酸脱水酵素で代替することを試みました。まず、糖酸デヒドラターゼの結合ポケットを、より小さく、より疎水性の高いDHIVに対応するように変更することを試みましたが、成功しませんでした。次に、化学的に活性化された基質アナログを使用して、糖酸デヒドラターゼまたは他のエノラーゼスーパーファミリー酵素と反応させた。Pseudomonas putida (PpManR)由来のマンデル酸ラセマーゼおよびSalmonella typhimurium (StPutD)由来の仮定的な糖酸脱水酵素は、クロロラクト酸(CLD)に対してβ-脱離活性を示した。CPDとミディアムスループット選択を組み合わせることで、CLDに対するPpManRのkcat/KMは4倍に改善された。しかし、これらの酵素バリアントはDHIVに対する脱水活性を示さなかった。最後に、リン酸化も有効な活性化機構であると仮定して、PitM3K（Picrophilus torridus）由来のメバロネート-3-キナーゼ（M3K）がDHIVと混合するとアデノシン三リン酸（ATP）加水分解活性を示し、DHIVに対するリン酸化活性を示すことを発見した。また、PpManR または StPutD を用いて、3-ホスホ-DHIV を基質として受容するように改変したが、目的とする活性を有する変異体は得られなかった。

Dihydroxy-acid dehydratase (DHAD) catalyzes the dehydration of R-2,3-dihydroxyisovalerate (DHIV) to 2-ketoisovalerate (KIV) using an Fe-S cluster as a cofactor, which is sensitive to oxidation and expensive to synthesize. In contrast, sugar acid dehydratases catalyze the same chemical reactions using a magnesium ion. Here, we attempted to substitute the high-cost DHAD with a cost-efficient engineered sugar acid dehydratase using computational protein design (CPD). First, we tried without success to modify the binding pocket of a sugar acid dehydratase to accommodate the smaller, more hydrophobic DHIV. Then, we used a chemically activated substrate analog to react with sugar acid dehydratases or other enolase superfamily enzymes. Mandelate racemase from Pseudomonas putida (PpManR) and the putative sugar acid dehydratase from Salmonella typhimurium (StPutD) showed beta-elimination activity towards chlorolactate (CLD). CPD combined with medium-throughput selection improved the PpManR kcat/KM for CLD by four-fold. However, these enzyme variants did not show dehydration activity towards DHIV. Lastly, assuming phosphorylation could also be a good activation mechanism, we found that mevalonate-3-kinase (M3K) from Picrophilus torridus (PtM3K) exhibited adenosine triphosphate (ATP) hydrolysis activity when mixed with DHIV, indicating phosphorylation activity towards DHIV. Engineering PpManR or StPutD to accept 3-phospho-DHIV as a substrate was performed, but no variants with the desired activity were obtained.