Plasmodium vivaxのセントロメアおよびプロモーター活性をPlasmodium yoeliiを用いて検証する

Validation of Plasmodium vivax centromere and promoter activities using Plasmodium yoelii.

• Kittisak Thawnashom
• Miho Kaneko
• Phonepadith Xangsayarath
• Nattawat Chaiyawong
• Kazuhide Yahata
• Masahito Asada
• John H Adams
• Osamu Kaneko

抄録

ビバックス原虫はアフリカ以外の国ではマラリアの主要な原因であり、影響を受ける国の健康と経済に大きな負担を与えています。ビバックス原虫の根絶の大きな障害は、再発感染を引き起こす休眠状態にあるヒプノゾイト肝段階と、この段階をクリアする抗マラリア薬が限られていることです。この寄生虫のヒプノゾイトやその他のユニークな生物学的側面の研究は、継続的なin vitro実験室培養システムの欠如と、遺伝子操作のための分子ツールの不足によって妨げられている。本研究では、P. vivaxの遺伝子操作に利用できる分子ツールの開発を目指している。P. vivax のセントロメア配列（PvCEN）をクローニングし、GFP マーカーを発現するエピソームセントロメアベースのプラスミドを構築した。セントロメア活性は、げっ歯類マラリア寄生虫Plasmodium yoeliiを用いて評価した。その結果、無性期の寄生虫では、薬剤を投与していない状態でプラスミドを安定的に保持することができ、4週間後には約45％の寄生虫がプラスミドを保持していることがわかった。同じ保持率は、ネイティブのP. yoeliiセントロメア（PyCEN）ベースの対照プラスミドを保有する寄生虫でも観察された。核分裂あたりのプラスミドの分離効率は、セントロメアを持たないプラスミドを保有している対照寄生虫では～90％であったのに対し、PvCENを保有している寄生虫では99％以上であった。さらに、蚊から分離された卵胞と唾液腺胞子虫の両方で明確なGFPシグナルが観察された。肝期発生後の血液期の寄生虫では、PvCEN寄生虫のGFP陽性率は対照のPyCEN寄生虫と同程度であった。このように、PvCENプラスミドは寄生虫のライフサイクルを通して維持されていた。また、いくつかのP. vivaxプロモーターの活性を検証し、hsp70プロモーター（〜1kb）が寄生虫のライフサイクルを通して活性であることを示した。これは、P. vivaxのセントロメアの機能的な特徴を明らかにした初めてのデータであり、今後のP. vivaxの生物学的研究に利用することができます。

Plasmodium vivax is the leading cause of malaria outside Africa and represents a significant health and economic burden on affected countries. A major obstacle for P. vivax eradication is the dormant hypnozoite liver stage that causes relapse infections and the limited antimalarial drugs that clear this stage. Advances in studying the hypnozoite and other unique biological aspects of this parasite are hampered by the lack of a continuous in vitro laboratory culture system and poor availability of molecular tools for genetic manipulation. In this study, we aim to develop molecular tools that can be used for genetic manipulation of P. vivax. A putative P. vivax centromere sequence (PvCEN) was cloned and episomal centromere based plasmids expressing a GFP marker were constructed. Centromere activity was evaluated using a rodent malaria parasite Plasmodium yoelii. A plasmid carrying PvCEN was stably maintained in asexual-stage parasites in the absence of drug pressure, and approximately 45% of the parasites retained the plasmid four weeks later. The same retention rate was observed in parasites possessing a native P. yoelii centromere (PyCEN)-based control plasmid. The segregation efficiency of the plasmid per nuclear division was > 99% in PvCEN parasites, compared to ~90% in a control parasite harboring a plasmid without a centromere. In addition, we observed a clear GFP signal in both oocysts and salivary gland sporozoites isolated from mosquitoes. In blood-stage parasites after liver stage development, GFP positivity in PvCEN parasites was comparable to control PyCEN parasites. Thus, PvCEN plasmids were maintained throughout the parasite life cycle. We also validated several P. vivax promoter activities and showed that hsp70 promoter (~1 kb) was active throughout the parasite life cycle. This is the first data for the functional characterization of a P. vivax centromere that can be used in future P. vivax biological research.