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CASP9（カスパーゼ9）は、ミトコンドリアの恒常性を制御し、オートファゴソームの成熟に必須である
CASP9 (caspase 9) is essential for autophagosome maturation through regulation of mitochondrial homeostasis.
PMID: 31818185 DOI: 10.1080/15548627.2019.1695398.
抄録
CASP9（カスパーゼ9）は、内在性のアポトーシスを誘発する、よく知られた開始カスパーゼである。また、最近の研究では、マクロオートファジー/オートファジー制御など、CASP9の非アポトーシス的な役割が示唆されています。しかし、オートファジーにおけるCASP9の関与やその分子機構はよくわかっていません。本研究では、CASP9がミトコンドリアの恒常性維持を介してオートファジーを積極的に制御していることを明らかにした。成長因子やアミノ酸欠乏によるオートファジーはCASP9を活性化したが、アポトーシスは認められなかった。薬理学的な阻害または遺伝的なアブレーションにより、オートファジーのフラックスが減少したが、CASP9の異所性発現によりオートファジーの欠陥が救済された。ノックアウト（KO）細胞では、ファゴフォア膜の開始と伸長は正常であったが、膜の封鎖とオートファゴソームの成熟は損なわれ、オートファゴソームの寿命は延長した。アブレーションは不活性なATG3の蓄積を引き起こし、Atg8ファミリーメンバーの脂質化を減少させ、最も深刻なのはGABARAPL1の脂質化であった。さらに、ミトコンドリア膜電位の脱分極、活性酸素種産生の低下、ミトコンドリア融合分裂タンパク質の異常蓄積など、ミトコンドリアの形態異常を引き起こした。CASP9 発現または外因的に HO を添加した KO 細胞では、ATG3 レベルと Atg8 ファミリーメンバーの脂質状態が修正され、オートファジーのフラックスが回復した。また、ミトコンドリアの欠陥はCASP9の発現のみで改善されたが、HOの発現は改善されなかったことから、ミトコンドリアのホメオスタシスはCASP9によって制御されていることが明らかになった。我々の知見は、CASP9活性を介したミトコンドリアとオートファジーの間の新たな制御リンク、特にAtg8ファミリー結合系の適切な操作とオートファゴソームの閉鎖と成熟を示唆している。ＡＡ：アミノ酸；ＡＣＤ：オートファジー細胞死；ＡＣＴＢ：アクチンβ；ＡＮＸＡ５：アネキシンＡ５；ＡＰＡＦ１：アポトーシスペプチダーゼ活性化因子１；ＡＴｇ：オートファジー関連；ＡＴＧ１６Ｌ１：オートファジー関連１６様体；ＢａｆＡ：バフィロマイシンＡ；ＢＣＬ２．BCL2アポトーシス調節因子；BECN1：ベクリン1；CARD：カスパーゼリクルートドメイン含有；CASP：カスパーゼ；CM-HDCFDA：クロロメチル-2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート；Δψm：ミトコンドリア膜電位；DN：ドミナントネガティブ；DNM1L/DRP1：ダイナミン1様；EBSS：アールバランス塩溶液；GABARAP.ＧＡＢＡ型Ａ受容体関連蛋白質；ＧＡＢＡＲＡＰＬ１：ＧＡＢＡ型Ａ受容体関連蛋白質様１；ＧＡＢＡＲＡＰＬ２．ＧＡＢＡ型Ａ受容体関連蛋白質様２；ＨＣＮ：海馬神経幹細胞；ＩＡＭ：内側オートファゴソーム膜；ＩＮＳ：インスリン；ＫＯ：ノックアウト；ＬＥＨＤ：Ｚ-ＬＥＨＤ-ｆｍｋ；ＭＡＰ１ＬＣ３．微小管関連タンパク質１軽鎖３；ＭＦＮ１：マイトフシン１；ＭＦＮ２：マイトフシン２；ＭＴＯＲＣ１：ラパマイシンキナーゼ複合体１の機械論的標的；ＰＡＲＰ１：ポリ（ＡＤＰ-リボース）ポリメラーゼ１；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＰＥ．ホスファチジルエタノールアミン；ＲＯＳ：活性酸素種；ｓｇＲＮＡ：シングルガイドＲＮＡ；ＳＲ-ＳＩＭ：超解像構造化照明顕微鏡；ＳＱＳＴＭ１：シークエストソーム１；ＳＴＳ：スタウロスポリン；ＳＴＸ１７．シンタキシン17；TMRE：テトラメチルローダミンエチルエステル；TUBB：チューブリンβクラスI；ULK1：unk-51様オートファジー活性化キナーゼ1；WT：野生型；ZFYVE1/DFCP1：ジンクフィンガーFYVE型含有1．
CASP9 (caspase 9) is a well-known initiator caspase which triggers intrinsic apoptosis. Recent studies also suggest various non-apoptotic roles of CASP9, including macroautophagy/autophagy regulation. However, the involvement of CASP9 in autophagy and its molecular mechanisms are not well understood. Here we report the non-apoptotic function of CASP9 in positive regulation of autophagy through maintenance of mitochondrial homeostasis. Growth factor or amino acid deprivation-induced autophagy activated CASP9, but without apoptotic features. Pharmacological inhibition or genetic ablation of decreased autophagy flux, while ectopic expression of CASP9 rescued autophagy defects. In knockout (KO) cells, initiation and elongation of phagophore membranes were normal, but sealing of the membranes and autophagosome maturation were impaired, and the lifetime of autophagosomes was prolonged. Ablation of caused an accumulation of inactive ATG3 and decreased lipidation of the Atg8-family members, most severely that of GABARAPL1. Moreover, it resulted in abnormal mitochondrial morphology with depolarization of the membrane potential, reduced reactive oxygen species production, and aberrant accumulation of mitochondrial fusion-fission proteins. CASP9 expression or exogenously added HO in the KO cells corrected the ATG3 level and lipidation status of Atg8-family members, and restored autophagy flux. Of note, only CASP9 expression but not HO rescued mitochondrial defects, revealing regulation of mitochondrial homeostasis by CASP9. Our findings suggest a new regulatory link between mitochondria and autophagy through CASP9 activity, especially for the proper operation of the Atg8-family conjugation system and autophagosome closure and maturation.: AA: amino acid; ACD: autophagic cell death; ACTB: actin beta; ANXA5: annexin A5; APAF1: apoptotic peptidase activating factor 1; Atg: autophagy related; ATG16L1: autophagy related 16 like 1; BafA: bafilomycin A; BCL2: BCL2 apoptosis regulator; BECN1: beclin 1; CARD: caspase recruitment domain containing; CASP: caspase; CM-HDCFDA: chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate; Δψm: mitochondrial membrane potential; DN: dominant-negative; DNM1L/DRP1: dynamin 1 like; EBSS: Earle's balanced salt solution; GABARAP: GABA type A receptor-associated protein; GABARAPL1: GABA type A receptor associated protein like 1; GABARAPL2: GABA type A receptor associated protein like 2; HCN: hippocampal neural stem cells; IAM: inner autophagosome membrane; INS: insulin; KO: knockout; LEHD: Z-LEHD-fmk; MAP1LC3: microtubule associated protein 1 light chain 3; MFN1: mitofusin 1; MFN2: mitofusin 2; MTORC1: mechanistic target of rapamycin kinase complex 1; PARP1: poly(ADP-ribose) polymerase 1; PBS: phosphate-buffered saline; PE: phosphatidylethanolamine; ROS: reactive oxygen species; sgRNA: single guide RNA; SR-SIM: super-resolution structured illumination microscopy; SQSTM1: sequestosome 1; STS: staurosporine; STX17: syntaxin 17; TMRE: tetramethylrhodamine ethyl ester; TUBB: tubulin beta class I; ULK1: unc-51 like autophagy activating kinase 1; WT: wild type; ZFYVE1/DFCP1: zinc finger FYVE-type containing 1.