チラコイドTatトランスロカーゼへのTatBの機能的再構成

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Biochim Biophys Acta Mol Cell Res.2020 02;1867(2):118606. S0167-4889(19)30214-9. doi: 10.1016/j.bbamcr.2019.118606.Epub 2019-11-14.

チラコイドTatトランスロカーゼへのTatBの機能的再構成

Functional reconstitution of TatB into the thylakoidal Tat translocase.

Sarah Zinecker
Mario Jakob
Ralf Bernd Klösgen

PMID: 31733260 DOI: 10.1016/j.bbamcr.2019.118606.

抄録

チラコイドツインアルギニン蛋白質輸送（Tat）機械系の膜貫通型TatBC受容体複合体の構成要素であるチラコイドTatBの機能解析のための実験系を確立した。この目的のために、単離されたエンドウのチラコイドの本質的なTatB活性は、アフィニティー精製抗体によって阻害され、インビトロ翻訳によって得られたか、または大腸菌で異種発現した後に精製されたTatBタンパク質でアッセイを補うことによって置換された。このような再構成されたチラコイドのTat輸送活性は、本物のTat基質pOEC16で分析され、並行して分析された模擬処理されたチラコイド小胞の活性の20〜25％に日常的に達した。対照的に、チラコイドTatBのN末端膜貫通ヘリックス以外の全てを含む精製抗原をアッセイに添加してもTat輸送の再構成は起こらなかったが、これは輸送が添加されたTatBタンパク質の活性に厳密に依存しており、抗体放出による本質的なTatB活性の回復に起因するものではないことを確認するものであった。意外なことに、TatBC受容体複合体に組み立てることができないと考えられていた変異TatBタンパク質（TatB,E10C）でさえも、低いがかなりの輸送再構成を示したことから、このアプローチの感度とタンパク質変異体の更なる機能解析への適合性が示された。最後に、TatBの要求量の定量化は、Tat依存性のチラコイド輸送を達成するためにはTatAとTatBがほぼ等モル量で必要であることを示唆している。

We have established an experimental system for the functional analysis of thylakoidal TatB, a component of the membrane-integral TatBC receptor complex of the thylakoidal Twin-arginine protein transport (Tat) machinery. For this purpose, the intrinsic TatB activity of isolated pea thylakoids was inhibited by affinity-purified antibodies and substituted by supplementing the assays with TatB protein either obtained by in vitro translation or purified after heterologous expression in E. coli. Tat transport activity of such reconstituted thylakoids, which was analysed with the authentic Tat substrate pOEC16, reached routinely 20-25% of the activity of mock-treated thylakoid vesicles analysed in parallel. In contrast, supplementation of the assays with the purified antigen comprising all but the N-terminal transmembrane helix of thylakoidal TatB did not result in Tat transport reconstitution which confirms that transport relies strictly on the activity of the TatB protein added and is not due to restoration of the intrinsic TatB activity by antibody release. Unexpectedly, even a mutated TatB protein (TatB,E10C) assumed to be incapable of assembling into the TatBC receptor complex showed low but considerable transport reconstitution underlining the sensitivity of the approach and its suitability for further functional analyses of protein variants. Finally, quantification of TatB demand suggests that TatA and TatB are required in approximately equimolar amounts to achieve Tat-dependent thylakoid transport.