真核生物のキャップ依存性翻訳開始キネティクスのためのin vitro単一分子アッセイ

An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics.

• Hongyun Wang
• Lexi Sun
• Anthony Gaba
• Xiaohui Qu

抄録

真核生物のmRNAは、主にキャップ依存性の翻訳経路を介して翻訳されています。このようなキャップ依存性翻訳の速度制限ステップである翻訳開始は、翻訳制御機構の主要なターゲットとなっています。キャップ依存性の翻訳開始速度を特徴づけるための高解像度の技術はまだありません。ここでは、キャップ依存性翻訳の開始とペプチド鎖伸長の両方の速度を特徴づけることができるin vitroの単一分子アッセイを報告する。驚くべきことに、第一ラウンドの開始時間のヒストグラムは非常に非対称であり、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAとの翻訳反応における平均ペプチド合成時間の数倍の大きな時間範囲にまたがっています。ヒストグラムと単一分子の軌跡の両方が、mRNA分子間の翻訳活性の非同期性が予想外に高いことを明らかにした。さらに、mRNAの5'未翻訳領域（UTR）の途中に小さなステムループ（ΔG = -4.8 kcal/mol）を挿入することにより、我々のアッセイは、バルク発光カイネティクスでは解決できなかった出芽酵母の開始速度の小さな変化をロバストに検出します。最後に、我々は、出芽酵母、小麦胚芽、およびウサギの網状細胞溶解物から調製した抽出物を使用して、異なる無細胞翻訳系へのこのアッセイの一般的な適用性を実証した。このアッセイは、真核生物のキャップ依存性の翻訳開始および翻訳制御のメカニズムの研究を促進するものである。

Eukaryotic mRNAs are predominantly translated via the cap-dependent pathway. Initiation is a rate-limiting step in cap-dependent translation and is the main target of translational control mechanisms. There is a lack of high-resolution techniques for characterizing the cap-dependent initiation kinetics. Here, we report an in vitro single-molecule assay that allows characterization of both initiation and peptide chain elongation kinetics for cap-dependent translation. Surprisingly, the histogram of the first-round initiation time is highly asymmetrical and spans a large time range that is several-fold greater than the average peptide synthesis time in translation reactions with a firefly luciferase-encoding mRNA. Both the histogram and single-molecule trajectories reveal an unexpected high-degree of asynchrony in translation activity between mRNA molecules. Furthermore, by inserting a small stem-loop (ΔG = -4.8 kcal/mol) in the middle of the mRNA 5' untranslated region (UTR), our assay robustly detects small changes in budding yeast initiation kinetics, which could not be resolved by bulk luminescence kinetics. Lastly, we demonstrate the general applicability of this assay to distinct cell-free translation systems by using extracts prepared from budding yeast, wheat germ, and rabbit reticulocyte lysates. This assay should facilitate mechanistic studies of eukaryotic cap-dependent translation initiation and translational control.

© The Author(s) 2019. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.