マウス食道におけるカルシウム感知受容体の欠失がバリア機能を変化させることを明らかにした

Calcium-sensing receptor deletion in the mouse esophagus alters barrier function.

• Nazih L Nakhoul
• Chia-Ling Tu
• Karen L Brown
• M Toriqul Islam
• Anna G Hodges
• Solange M Abdulnour-Nakhoul

抄録

カルシウム感知受容体（CaSR）は、細胞が細胞外Ca濃度のわずかな変化に反応する分子センサーである。CaSRは、消化管における腺分泌や体液分泌、皮膚ケラチノサイトの分化・増殖を制御する役割を果たすことが報告されています。CaSRは食道上皮に存在するが、その役割は明らかにされていない。我々は、CaSR 遺伝子のエクソン 7 の側面に loxP サイトが存在するケラチン 5 複合変異体を作製することにより、マウス食道の CaSR を削除した。複数回のタモキシフェン注射により組換えを開始し、ゲノム DNA の PCR 解析によりエクソン 7 欠失を実証した。定量的リアルタイムPCRとウエスタンブロット解析により、ノックアウトマウス()では、対照マウスに比べてCaSRのmRNAとタンパク質の発現が有意に減少した。食道組織の顕微鏡検査では、レテペグの伸長、角化と層化の異常、腔内上皮表面への細菌の蓄積などの形態的変化が認められた。ウェスタン分析では、付着性接合タンパク質E-カドヘリンおよびβカテニン、タイトジャンクションタンパク質claudin-1、4、および5のレベルが有意に低下していた。アクチンリモデリングに関与する小GTPaseタンパク質Rac/Cdc42のレベルも減少した。ウスティングチャンバー実験では、ノックアウト（KO）組織では有意に低い経上皮抵抗性が示された。さらに、腔内から血清へのフルオレセインデキストラン（4 kDa）のフラックスはKO組織で高かった。これらのデータは、CaSRがケラチン化と細胞接合体の制御に関与しており、食道のバリア機能維持に重要な役割を果たしていることを示唆している。食道成層扁平上皮は、基底細胞の継続的な増殖と分化によってその完全性を維持している。ここでは、基底細胞からGタンパク質共役型受容体であるカルシウム感知受容体を欠失させると、上皮の構造やバリア機能が破壊されることを示している。

Calcium-sensing receptor (CaSR) is the molecular sensor by which cells respond to small changes in extracellular Ca concentrations. CaSR has been reported to play a role in glandular and fluid secretion in the gastrointestinal tract and to regulate differentiation and proliferation of skin keratinocytes. CaSR is present in the esophageal epithelium, but its role in this tissue has not been defined. We deleted CaSR in the mouse esophagus by generating keratin 5 compound mutants, in which loxP sites flank exon 7 of CaSR gene. Recombination was initiated with multiple tamoxifen injections, and we demonstrated exon 7 deletion by PCR analysis of genomic DNA. Quantitative real-time PCR and Western blot analyses showed a significant reduction in CaSR mRNA and protein expression in the knockout mice () as compared with control mice. Microscopic examination of esophageal tissues showed morphological changes including elongation of the rete pegs, abnormal keratinization and stratification, and bacterial buildup on the luminal epithelial surface. Western analysis revealed a significant reduction in levels of adherens junction proteins E-cadherin and β catenin and tight junction protein claudin-1, 4, and 5. Levels of small GTPase proteins Rac/Cdc42, involved in actin remodeling, were also reduced. Ussing chamber experiments showed a significantly lower transepithelial resistance in knockout (KO) tissues. In addition, luminal-to-serosal-fluorescein dextran (4 kDa) flux was higher in KO tissues. Our data indicate that CaSR plays a role in regulating keratinization and cell-cell junctional complexes and is therefore important for the maintenance of the barrier function of the esophagus. The esophageal stratified squamous epithelium maintains its integrity by continuous proliferation and differentiation of the basal cells. Here, we demonstrate that deletion of the calcium-sensing receptor, a G protein-coupled receptor, from the basal cells disrupts the structure and barrier properties of the epithelium.