デノボデザイン：アクチビンAを大腸菌の細胞質周囲空間に輸送するTatトランスロケーション経路のための新規シグナルペプチド

Denovo designing: a novel signal peptide for tat translocation pathway to transport activin A to the periplasmic space of E. coli.

• Farshid Zandsalimi
• Zahra Hajihassan
• Roghaye Hamidi

抄録

目的:

ツインアルギニン転座（Tat）経路は、細胞質膜を介して折り畳まれたタンパク質を輸出する細菌の分泌戦略の一つです。

OBJECTIVES: The twin-arginine translocation (Tat) pathway is one of the bacterial secretory strategies which exports folded proteins across the cytoplasmic membrane.

結果:

本研究では、ここで組換えタンパク質モデルとして用いたヒトアクチビンAの分泌を目的とした新規Tatシグナルペプチドを設計した。その際、Haloferax volcanii, Halobacterium salinarum, Escherichia coliのTat特異的シグナルペプチドをClustalWプログラムを用いてアラインメントし、保存されている残基やより頻繁に使用されている残基を決定した。最初のシグナルペプチド配列を作成し、いくつかの変異を加えた後、TatP, PRED-TAT, Phobiusなどの有名なソフトウェアを用いて、この設計されたシグナルペプチドの効率性を評価した。次に、HADDOCKサーバーを用いて、Tat分泌系の開始タンパク質であるTatCとアクチビンAとの結合エネルギーが最も低い新規シグナルペプチドとの最適な複合体を構築し、FoldXモジュールを用いて5.5kcal/molのΔΔG値を計算した。その後、この新規シグナルペプチドのヒトアクチビンAの大腸菌ロゼッタ神(DE3)株の細胞質周囲への分泌効率を実験的に評価し、その活性を調べるために、Sec経路シグナルペプチドとしてイラン産バチルス苔癬状菌α-アミラーゼ酵素シグナルペプチドをポジティブコントロールとして用いた。ImageJソフトウェアを用いたウエスタンブロットバンドの定量分析により、新規設計のシグナルペプチドの高い分泌能が確認された。また、円形二色性(CD)分光法により、アクチビンAの適切な二次構造が確認された。また、アクチビンAの生物学的活性は、ICP法を用いてヘモグロビン量やFeイオン量を測定することにより、K562赤血球から赤血球への分化を確認した。

RESULTS: In the present study, we designed a novel Tat-signal peptide for secretion of human activin A used as a recombinant protein model here. In doing so, Haloferax volcanii, Halobacterium salinarum, and Escherichia coli Tat specific signal peptides were aligned by ClustalW program to determine conserved and more frequently used residues. After making the initial signal peptide sequence and doing some mutations, efficiency of this designed signal peptide was evaluated using a set of well-known software programs such as TatP, PRED-TAT, and Phobius. Then the best complex between TatC as an initiator protein in Tat secretory machine and the new designed signal peptide connected to activin A with the lowest binding energy was constructed by HADDOCK server, and ΔΔG value of - 5.5 kcal/mol was calculated by FoldX module. After that, efficiency of this novel signal peptide for secretion of human activin A to the periplasmic space of E. coli Rosetta-gami (DE3) strain was experimentally evaluated; to scrutinize the activity of the novel signal peptide, Iranian Bacillus Licheniformis α-Amylase enzyme signal peptide as a Sec pathway signal peptide was used as a positive control. The quantitative analysis of western blotting bands by ImageJ software confirmed the high secretion ability of the new designed signal peptide; translocation of 69% of the produced recombinant activin A to the periplasmic space of E. coli. Circular Dichroism (CD) spectroscopy technique also approved the proper secondary structure of activin A secreted to the periplasmic space. The biological activity of activin A was also confirmed by differentiation of K562 erythroleukemia cells to the red blood cell by measuring the amount of hemoglobin or Fe ion using ICP method.

結論:

結論として、この新規に設計されたシグナルペプチドは、他の組換えタンパク質を大腸菌のペリプラズム空間に効率よく分泌させることができる。

CONCLUSIONS: In conclusion, this novel designed signal peptide can be used to secrete any other recombinant proteins to the periplasmic space of E. coli efficiently.