伝統的な鋸歯状腺腫のモデルを開発するためのヒト大腸由来オルガノイドの染色体工学

Chromosome Engineering of Human Colon-Derived Organoids to Develop a Model of Traditional Serrated Adenoma.

• Kenta Kawasaki
• Masayuki Fujii
• Shinya Sugimoto
• Keiko Ishikawa
• Mami Matano
• Yuki Ohta
• Kohta Toshimitsu
• Sirirat Takahashi
• Naoki Hosoe
• Shigeki Sekine
• Takanori Kanai
• Toshiro Sato

抄録

伝統的鋸歯状腺腫（TSA）は、ユニークな組織学的特徴を持つ稀な大腸ポリープである。R-スポンディン遺伝子の融合がTSAで発見されているが、ヒト組織の染色体工学的プラットフォームがないため、これらの融合がTSAの発生に十分であるかどうかは明らかにされていない。我々は、CRISPR-Cas9を媒介としたヒト大腸オルガノイドの染色体および遺伝子改変を用いて、TSAに見られるR-spondin遺伝子の融合やその他の遺伝子改変の影響を研究した。

BACKGROUND & AIMS: Traditional serrated adenomas (TSAs) are rare colorectal polyps with unique histologic features. Fusions in R-spondin genes have been found in TSAs, but it is not clear whether these are sufficient for TSA development, due to the lack of a chromosome engineering platform for human tissues. We studied the effects of fusions in R-spondin genes and other genetic alterations found in TSA using CRISPR-Cas9-mediated chromosome and genetic modification of human colonic organoids.

方法:

我々は、CRISPR-Cas9（染色体改変オルガノイド）を用いて、TP53 の破壊の有無にかかわらず、R-spondin 遺伝子に関与する染色体再配列をヒト大腸オルガノイドに導入した。次に、我々は、V600E置換をコードするBRAFへの変異をノックし、GREM1トランスジーンを過剰発現させた；オルガノイドをNOGマウスの大腸に移植し、異種移植片腫瘍の成長を測定した。大腸組織を採取し、免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーションで分析した。また、患者由来のTSAオルガノイド2系統を樹立し、その遺伝的特徴と表現型を特徴付けた。染色体改変オルガノイドにダイメライザー誘導性自殺遺伝子とLGR5遺伝子下流の蛍光マーカーを発現する二色性カセットを挿入し、ダイメライザーを添加することでLGR5細胞を根絶した。腫瘍を担持したマウスにダイマイザーを腹腔内注射して、LGR5発現細胞を除去した。

METHODS: We introduced chromosome rearrangements that involve R-spondin genes into human colonic organoids, with or without disruption of TP53, using CRISPR-Cas9 (chromosome-engineered organoids). We then knocked a mutation into BRAF encoding the V600E substitution and overexpressed the GREM1 transgene; the organoids were transplanted into colons of NOG mice and growth of xenograft tumors was measured. Colon tissues were collected and analyzed by immunohistochemistry or in situ hybridization. We also established 2 patient-derived TSA organoid lines and characterized their genetic features and phenotypes. We inserted a bicistronic cassette expressing a dimerizer-inducible suicide gene and fluorescent marker downstream of the LGR5 gene in the chromosome-engineered organoids; addition of the dimerizer eradicates LGR5 cells. Some tumor-bearing mice were given intraperitoneal injections of the dimerizer to remove LGR5-expressing cells.

結果:

オルガノイドの染色体工学は、TP53を破壊するか、IGF1およびFGF2を含む培地で培養する必要があった。マウスの大腸では、BRAFとR-スポンディン遺伝子の融合を発現したオルガノイドが扁平な鋸歯状の病変を形成した。患者由来のTSAオルガノイドは外因性R-spondinとは独立して成長し、1系統はNogginとは独立して成長した。BRAFとR-スポンディン遺伝子の融合に加えてGREM1を過剰発現したオルガノイドは、TSAに類似した組織学的特徴を持つマウスにポリーポイド腫瘍を形成した。LGR5を発現する細胞を欠損させた後も、Xenograft腫瘍は持続した。

RESULTS: Chromosome engineering of organoids required disruption of TP53 or culture in medium containing IGF1 and FGF2. In colons of mice, organoids that expressed BRAF and fusions in R-spondin genes formed flat serrated lesions. Patient-derived TSA organoids grew independent of exogenous R-spondin, and 1 line grew independent of Noggin. Organoids that overexpressed GREM1, in addition to BRAF and fusions in R-spondin genes, formed polypoid tumors in mice that had histologic features similar to TSAs. Xenograft tumors persisted after loss of LGR5-expressing cells.

結論:

私たちは、ヒト正常結腸オルガノイドの効率的な染色体工学を実証しました。その結果、ヒトTSAに見られるヒト結腸オルガノイドに遺伝子や染色体の改変を導入し、マウスの結腸オルガノイドから増殖した腫瘍はTSAの病理学的特徴を持つようになった。このモデルは、RSPO融合遺伝子とGREM1の過剰発現を有するヒト大腸腫瘍の進行を研究するために使用される可能性がある。

CONCLUSIONS: We demonstrated efficient chromosomal engineering of human normal colon organoids. We introduced genetic and chromosome alterations into human colon organoids found in human TSAs; tumors grown from these organoids in mice had histopathology features of TSAs. This model might be used to study progression of human colorectal tumors with RSPO fusion gene and GREM1 overexpression.

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