で発現したモノクローナル抗体の内部翻訳開始領域の特性評価を行った

Characterization of the internal translation initiation region in monoclonal antibodies expressed in .

• Erik M Leith
• William B O'Dell
• Na Ke
• Colleen McClung
• Mehmet Berkmen
• Christina Bergonzo
• Robert G Brinson
• Zvi Kelman

抄録

モノクローナル抗体（mAbs）は、生物治療製品の開発のための重要なプラットフォームを表しています。ほとんどのmAbは哺乳類細胞で生産されていますが、治療用フラグメントを含むいくつかのmAbが作られています。NISTmAbは、オリジネーター生物製剤およびバイオシミラーの両方の開発を容易にするために広く利用できるようにした、よく特徴づけられた参照物質である。ここでは、コドン最適化されたコンストラクト（eNISTmAb）からNISTmAbを発現させると、その重鎖の切断されたバリアントが観察された。N末端タンパク質の配列決定と突然変異誘発解析から、この切断はeNISTmAb内のGTGコドン（Valをコードする）からの内部翻訳開始によるものであることが示された。この翻訳は、弱いShine-Dalgarno配列から開始し、リボソームタンパク質S1結合部位によって促進されることを、計算機的・生化学的アプローチを用いて実証した。また、mAb adalimumab（薬剤Humiraのアミノ酸配列）をリボソームタンパク質のS1結合部位で発現させた場合にも、同様の内部開始が観察された。 これらの内部開始領域は、発現のためにコドンを最適化した結果、意図しない結果であった可能性が高く、その由来となるアミノ酸パターンはPro-Ser-Valモチーフであることが確認された。本研究で得られた知見がタンパク質の発現とコドン最適化に与える影響について議論し、内部翻訳開始と切断生成物形成の可能性を低減するための可能な戦略について概説する。

Monoclonal antibodies (mAbs) represent an important platform for the development of biotherapeutic products. Most mAbs are produced in mammalian cells, but several mAbs are made in , including therapeutic fragments. The NISTmAb is a well-characterized reference material made widely available to facilitate the development of both originator biologics and biosimilars. Here, when expressing NISTmAb from codon-optimized constructs in (eNISTmAb), a truncated variant of its heavy chain was observed. N-terminal protein sequencing and mutagenesis analyses indicated that the truncation resulted from an internal translation initiation from a GTG codon (encoding Val) within eNISTmAb. Using computational and biochemical approaches, we demonstrate that this translation initiates from a weak Shine-Dalgarno sequence and is facilitated by a putative ribosomal protein S1-binding site. We also observed similar internal initiation in the mAb adalimumab (the amino acid sequence of the drug Humira) when expressed in Of note, these internal initiation regions were likely an unintended result of the codon optimization for expression, and the amino acid pattern from which it is derived was identified as a Pro-Ser--Val motif. We discuss the implications of our findings for protein expression and codon optimization and outline possible strategies for reducing the likelihood of internal translation initiation and truncated product formation.