多重化された細胞ターゲティングのための一次抗体へのDNAの効率的な小規模コンジュゲーション

Efficient Small-Scale Conjugation of DNA to Primary Antibodies for Multiplexed Cellular Targeting.

• Glenn A O Cremers
• Bas J H M Rosier
• Roger Riera Brillas
• Lorenzo Albertazzi
• Tom F A de Greef

抄録

抗体の特異性とDNAナノテクノロジーのプログラム可能性の組み合わせは、蛍光ベースの読み出し法を用いて多数の細胞内標的を標識し、明確に区別するための強力なツールを科学界に提供してきました。一次抗体は多くの標的に対して市販されていますが、この親和性試薬のための一般的な化学量論的部位選択的DNA標識戦略は不足しています。ここでは、制御された数の短いオリゴヌクレオチド（ODN）で異なる宿主種の抗体を標識することができる小さな光架橋性タンパク質Gアダプターを使用して、普遍的な部位選択的コンジュゲーション法を提示します。重要なことに、我々は、このコンジュゲーション方法が直接市販の一次抗体上で、小規模で、ウシ血清アルブミンに対する交差反応性なしで行うことができることを示しています。さらに、我々は、機能を失うことなくDNA標識抗体を精製するための一般的なベンチトップ互換性のある戦略を提示します。タンパク質G-ODN標識一次抗体の応用は、フローサイトメトリー、DNA-PAINT、dSTORMを含む、蛍光読み出しを用いて細胞内標的を検出するためのよく知られた3つの方法を採用することによって実証されています。このようにして、ユニークなODN抗体コンジュゲートのライブラリを合成するための一般的かつ効率的なプラットフォームを確立し、DNAベースのプログラム可能なタグを使用して、ナノメートルの精度で細胞内の特徴を識別するための多重標識のためのより広範な使用を促進し、細胞構造と機能の理解を向上させることができます。

The combination of the specificity of antibodies and the programmability of DNA nanotechnology has provided the scientific community with a powerful tool to label and unambiguously distinguish a large number of subcellular targets using fluorescence-based read-out methods. Whereas primary antibodies are commercially available for a large class of targets, a general stoichiometric site-selective DNA labeling strategy for this affinity reagent is lacking. Here we present a universal, site-selective conjugation method using a small photo-cross-linkable protein G adaptor that allows labeling of antibodies of different host species with a controlled number of short oligonucleotides (ODNs). Importantly, we illustrate that this conjugation method can be directly performed on commercially available primary antibodies on a small scale and without cross-reactivity towards bovine serum albumin. In addition, we present a general benchtop-compatible strategy to purify DNA-labeled antibodies without a loss of function. The application of protein G-ODN-labeled primary antibodies is demonstrated by employing three well-known methods for detecting subcellular targets using fluorescence read-out, including flow cytometry, DNA-PAINT, and dSTORM. This work thus establishes a general and efficient platform for the synthesis of a library of unique ODN-antibody conjugates, facilitating the broader use of DNA-based programmable tags for multiplexed labeling to identify subcellular features with nanometer precision and improving our understanding of cellular structure and function.