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困難な土壌からの二本鎖および一本鎖DNAウイルスのためのウイルスメタゲノムの最適化に向けて
Towards optimized viral metagenomes for double-stranded and single-stranded DNA viruses from challenging soils.
PMID: 31309007 PMCID: PMC6612421. DOI: 10.7717/peerj.7265.
抄録
土壌は地球規模の炭素循環に影響を与えており、その微生物はその生物地球化学的処理や生態系の出力に重要な役割を果たしています。海洋系での研究に基づいて、土壌微生物に感染するウイルスは、死亡率、遺伝子の水平移動、代謝制御を介して宿主の活動を調節している可能性が高い。しかし、土壌中のウイルスからDNAを分離、単離、抽出する技術的な課題があるため、その役割はほとんど解明されていない。これらの課題のいくつかは全ゲノム増幅法を用いることで克服されてきたが、土壌ウイルスとそのゲノムの同一性を明らかにすることはできたものの、その遺伝的なバイアスが生態学的に意味のある解釈を妨げていた。ここでは、永久凍土の融解勾配に沿った3つの異なる土壌生息地において、ssDNAとdsDNAの両方のウイルスをよりよく捕らえるために、定量的に増幅されたウイルスメタゲノムを生成するための手順を実験的に最適化した。まず、異なるDNA抽出方法（PowerSoil、Wizardミニカラム、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を用いて、ウイルスDNAの量と質を評価しました。この結果、サンプルからのDNAの収量と質についてはPowerSoilが最も優れていると判断されましたが、各抽出キットで捕捉されたウイルス集団の約1/3はユニークなものであり、DNA抽出キット間でのバイアスの差が大きいことが示唆されました。第二に、再懸濁後のウイルス粒子の精製（塩化セシウム勾配（CsCl）による）とウイルス溶解法（加熱とビーズビーズ叩き）が、結果として得られたウイルス粒子に与える影響を評価しました。CsCl粒子精製後のDNA収量はほとんど検出されなかったが、未精製サンプルでは、熱溶解後のDNA収量はビーズ叩きよりも1～2倍多かった。ビクロムの品質は、メタゲノムが組み合わされたウイルスコンティグの数とサイズによって評価されたが、CsCl粒子の精製後には増加は見られなかったが、熱溶解ではビーズ叩きと比較して増加した。また、ssDNAウイルス回収のためのサンプル調製プロトコルも評価した。CsClで精製したサンプルと精製していないサンプルの両方において、ssDNAウイルスはAccel-NGS 1S Plus Library Kitを使用して回収することに成功しました。3つの土壌タイプすべてでssDNAウイルスが同定されたが、ビーズ叩きを使用したサンプルでは1つも同定されなかった。さらに、582個のdsDNA vOTUに対して13個のssDNA vOTUが同定されましたが、ssDNA vOTUはアセンブルされたリードの約4%しか占めておらず、これらのサンプルではdsDNAウイルスが優勢であることを示唆しています。この最適化されたアプローチは、以前に発表されたウイルス再懸濁プロトコルと組み合わされ、現在 protocols.io で利用可能な土壌用のサンプルからウイルスまでのプロトコルとなり、コミュニティからのフィードバックによって「生きた」プロトコルが作成されています。この集合的なアプローチは、土壌の物理化学的なばらつきが大きいため、土壌の種類に応じた最適化が必要となる可能性があることを考えると、特に価値のあるものとなるでしょう。この最適化されたプロトコルは、定量的に増幅されたウイルスのデータセットを開発するための出発点を提供し、有機物が豊富な土壌でのウイルス生態学的研究を可能にするのに役立ちます。
Soils impact global carbon cycling and their resident microbes are critical to their biogeochemical processing and ecosystem outputs. Based on studies in marine systems, viruses infecting soil microbes likely modulate host activities via mortality, horizontal gene transfer, and metabolic control. However, their roles remain largely unexplored due to technical challenges with separating, isolating, and extracting DNA from viruses in soils. Some of these challenges have been overcome by using whole genome amplification methods and while these have allowed insights into the identities of soil viruses and their genomes, their inherit biases have prevented meaningful ecological interpretations. Here we experimentally optimized steps for generating quantitatively-amplified viral metagenomes to better capture both ssDNA and dsDNA viruses across three distinct soil habitats along a permafrost thaw gradient. First, we assessed differing DNA extraction methods (PowerSoil, Wizard mini columns, and cetyl trimethylammonium bromide) for quantity and quality of viral DNA. This established PowerSoil as best for yield and quality of DNA from our samples, though ∼1/3 of the viral populations captured by each extraction kit were unique, suggesting appreciable differential biases among DNA extraction kits. Second, we evaluated the impact of purifying viral particles after resuspension (by cesium chloride gradients; CsCl) and of viral lysis method (heat vs bead-beating) on the resultant viromes. DNA yields after CsCl particle-purification were largely non-detectable, while unpurified samples yielded 1-2-fold more DNA after lysis by heat than by bead-beating. Virome quality was assessed by the number and size of metagenome-assembled viral contigs, which showed no increase after CsCl-purification, but did from heat lysis relative to bead-beating. We also evaluated sample preparation protocols for ssDNA virus recovery. In both CsCl-purified and non-purified samples, ssDNA viruses were successfully recovered by using the Accel-NGS 1S Plus Library Kit. While ssDNA viruses were identified in all three soil types, none were identified in the samples that used bead-beating, suggesting this lysis method may impact recovery. Further, 13 ssDNA vOTUs were identified compared to 582 dsDNA vOTUs, and the ssDNA vOTUs only accounted for ∼4% of the assembled reads, implying dsDNA viruses were dominant in these samples. This optimized approach was combined with the previously published viral resuspension protocol into a sample-to-virome protocol for soils now available at protocols.io, where community feedback creates 'living' protocols. This collective approach will be particularly valuable given the high physicochemical variability of soils, which will may require considerable soil type-specific optimization. This optimized protocol provides a starting place for developing quantitatively-amplified viromic datasets and will help enable viral ecogenomic studies on organic-rich soils.