大腸菌におけるO-アセチルホモセリンの高レベル生産に向けたタンパク質と代謝工学の融合

Combining Protein and Metabolic Engineering Strategies for High-Level Production of O-Acetylhomoserine in Escherichia coli.

• Liang Wei
• Qian Wang
• Ning Xu
• Jian Cheng
• Wei Zhou
• Guoqiang Han
• Huifeng Jiang
• Jun Liu
• Yanhe Ma

抄録

O-アセチルホモセリン（OAH）は、l-メチオニンや他の貴重な化合物の生産のための有望なプラットフォームケミカルです。しかし、相対的に力価が低く、収量も少ないため、工業的な生産やコスト効率の高い応用には限界があります。本研究では、大腸菌を用いて、タンパク質と代謝工学を組み合わせた効率的な OAH 産生株の構築に成功しました。まず、生合成経路の再構築、分解経路と競合経路の削除により、1.68 g/L の OAH を蓄積する OAH 産生株を作製した。その後、いくつかの代謝工学的戦略を実施して OAH 産生を改善した。その結果、副産物の蓄積を排除し、オキサロ酢酸の供給量を増加させ、前駆体ホモセリンの生合成を促進することでOAHの経路流速を向上させた結果、OAHの生産量は1.79倍に増加しました。さらに、速度制限酵素であるホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（MetXlm）の特性を進化保存解析と構造誘導型工学に基づいて改善するために、タンパク質工学を適用した。MetXlmのトリプルF147L-M182I-M240A変異体は12.15倍の特異的活性の増加を示し、最適化されたMetXlm変異体の発現により、OAHの産生が57.14%改善された。さらに、CoA生合成を促進し、ヘテロ型アセチル-CoA合成酵素（ACS）を過剰発現させ、NADP依存性ピルビン酸脱水素酵素（PDH）を導入することで、前駆体アセチル-CoAの供給とNADPHの生成も促進され、OAHの生合成が促進された。最終的に、設計株 OAH-7 は、7.5L のフィードバッチ発酵槽で 62.7 g/L の OAH を生産し、収量と生産性はそれぞれ 0.45 g/g グルコースと 1.08 g/L/h であり、これはこれまでに報告された中で最高の OAH 生産量であった。

O-acetylhomoserine (OAH) is a promising platform chemical for the production of l-methionine and other valuable compounds. However, the relative low titer and yield of OAH greatly limit its industrial production and cost-effective application. In this study, we successfully constructed an efficient OAH-producing strain with high titer and yield by combining protein and metabolic engineering strategies in E. coli. Initially, an OAH-producing strain was created by reconstruction of biosynthetic pathway and deletion of degradation and competitive pathways, which accumulated 1.68 g/L of OAH. Subsequently, several metabolic engineering strategies were implemented to improve the production of OAH. The pathway flux of OAH was enhanced by eliminating byproduct accumulation, increasing oxaloacetate supply and promoting the biosynthesis of precursor homoserine, resulting in a 1.79-fold increase in OAH production. Moreover, protein engineering was applied to improve the properties of the rate-limiting enzyme homoserine acetyltransferase (MetXlm) based on evolutionary conservation analysis and structure-guided engineering. The resulting triple F147L-M182I-M240A mutant of MetXlm exhibited a 12.15-fold increase in specific activity, and the optimized expression of the MetXlm mutant led to a 57.14% improvement in OAH production. Furthermore, the precursor acetyl-CoA supply and NADPH generation were also enhanced to facilitate the biosynthesis of OAH by promoting CoA biosynthesis, overexpressing heterogeneous acetyl-CoA synthetase (ACS), and introducing NADP-dependent pyruvate dehydrogenase (PDH). Finally, the engineered strain OAH-7 produced 62.7 g/L of OAH with yield and productivity values of 0.45 g/g glucose and 1.08 g/L/h, respectively, in a 7.5 L fed-batch fermenter, which was the highest OAH production ever reported.